張長麗 顧費晨 陳昌云 陸國飛 蔡雯希

(1南京曉莊學院生物化工與環(huán)境工程學院，南京 211171)

(2南京大學配位化學國家重點實驗室，南京 210093)

磁共振成像 (Magnetic resonance imaging，MRI)具有安全、快速及高分辨率顯示不同組織的精細對比等特點，廣泛用于醫(yī)學診斷領域[1-4]。磁共振造影劑是磁共振成像的重要輔助工具，可提高成像質量并擴展診斷范圍[5]。目前臨床所用造影劑主要為釓基配合物(如Gd-DTPA，Gd-DOTA)，這類造影劑具有穩(wěn)定性高、水溶性好及滲透壓低等優(yōu)點[6]，但其在體內停留時間短、易解離、弛豫率較低[7]。配體分子量的增加有助于配合物弛豫率的提高[8]。殼聚糖(CS)是來源廣泛的天然大分子，生物相容性好，殼聚糖經羧甲基化反應后生成的一類殼聚糖衍生物稱為羧甲基殼聚糖(carboxymethyl chitosan，CMCS)。羧基的引入使羧甲基殼聚糖的水溶性和金屬離子結合能力大大提高，其中N-羧甲基殼聚糖(NCMCS)可作為一種性能優(yōu)良的造影劑成分[9]。

Scheme 1 化合物DTPAA、DTPA-CS及DTPA-NCMCS的合成路線Scheme 1 Synthesis of compounds DTPAA,DTPA-CS and DTPA-NCMCS

本文將NCMCS與DTPA共價鏈接形成新配體，不僅DTPA對Gd（Ⅲ）具有很強配位能力，殼聚糖主鏈糖環(huán)側面大量的羥基和氨基也可能會對Gd（Ⅲ）形成附加配位作用[10]，使該金屬配合物在近生理條件下具有良好的穩(wěn)定性。另外，聚合殼聚糖在水中以纏繞團聚的分子構象存在[11]，這更有利于防止金屬離子外泄，從而實現(xiàn)降低毒性的目的。此外，引入較大分子量的NCMCS可增加配合物的分子量，從而增加配合物的弛豫性能。

本文用紅外光譜對合成的配體及配合物Gd-(DTPA-NCMCS)和 Gd-(DTPA-CS)進行了表征，用電感耦合等離子體質譜儀 (ICP-MS)分析了配合物中Gd（Ⅲ）的含量。進而研究了配合物的生物相容性和縱向弛豫性能，初步探討了其作為潛在磁共振成像造影劑的應用價值，為擴展N-羧甲基殼聚糖在磁共振成像領域中的應用提供了實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑及儀器

殼聚糖(CS，脫乙酰度不低于95%，粘度100～200 mPa·s)及羧甲基殼聚糖(NCMCS，10～1 000 mPa·s)均來自阿拉丁公司，合成中常用試劑和溶劑均為國內商業(yè)試劑。細胞實驗中所用的各類無機鹽均為Aldrich或Alfa的分析純試劑，水為經MILIPORE處理的超純水。紅外光譜表征由BRUKERVECTOR22傅立葉變換紅外光譜儀完成，配合物弛豫時間測試在SIEMENS公司Trio 3T磁共振成像設備上完成的，圖像處理軟件為Image J。配合物中Gd（Ⅲ）含量與細胞內Gd（Ⅲ）濃度的測定在Thermo公司的X SeriesⅡ電感耦合等離子體質譜儀上完成。

1.2 配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA的合成

1.2.1 二乙三胺五乙酸二環(huán)酸酐(DTPAA)的合成[12]

稱取 3.93 g(10 mmol，1 equiv.)DTPA懸浮于3.78 mL乙酸酐(40 mmol，4 equiv.)和 5 mL吡啶(60 mmol，6 equiv.)混合反應液中，攪拌回流 1 h，抽慮，分別用乙酸酐和無水乙醚洗3～5次，40℃下真空干燥至恒重，得白色粉末2.81 g，產率為78.5%。

1.2.2 DTPA-CS的合成[13]

稱取5.0 g殼聚糖(31 mmol氨基葡萄糖單元)溶于100 mL含10%醋酸的水溶液中，加入400 mL甲醇，再加入46.0 g(117 mmol)DTPAA，室溫攪拌24 h。抽濾，沉淀和乙醇混合繼續(xù)攪拌12 h。再抽濾，沉淀與pH值為11的NaOH溶液混合攪拌12 h。抽濾，沉淀用超純水反復洗滌，直到洗液呈中性。用無水乙醇重結晶，真空干燥，得白色固體6.2 g。

DTPA-NCMCS的合成方法同DTPA-CS，DTPANCMCS產物為黃色固體。

1.2.3 Gd-(DTPA-CS)配合物的合成[13]

稱取 0.45 g(1 mmol，1 equiv.)的 Gd(NO3)3·6H2O溶于5 mL含1%醋酸的水溶液中，稱取0.24 g的DTPA-CS溶于另外5 mL含1%醋酸的水溶液中。將兩種溶液混合，60℃攪拌24 h。濃縮反應液，加入一定量的無水乙醇，攪拌10 min后抽濾，用無水乙醇洗滌3次，真空干燥，得0.26 g棕色固體。

配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的合成方法同配合物 Gd-(DTPA-CS)，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)也為棕色固體。

1.2.4 Gd-DTPA的合成[14]

稱 取 4.51 g(10 mmol，1 equiv.) 的 Gd(NO3)3·6H2O溶于10 mL蒸餾水中。稱取4.13 g(10.5 mmol，1.05 equiv.)的 DTPA溶于 25 mL水中，滴加 2 mol·L-1的NaOH溶液使其溶解。將DTPA溶液滴加到硝酸釓溶液中，用2 mol·L-1的NaOH溶液調節(jié)反應液的pH值至6.8，80℃反應12 h。將反應液濃縮，加入適量的乙醇，析出固體，抽濾，用乙醇洗滌，真空干燥，即得白色固體Gd-DTPA，產率為82%。

1.3 配合物中Gd（Ⅲ）含量的測定

準確稱取一定質量的配合物Gd-(DTPANCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和 Gd-DTPA；加入高純濃硝酸室溫消解48 h，再加入質量分數(shù)為30%的H2O2室溫反應4 h，定容(硝酸的含量小于1%)，用ICPMS檢測Gd（Ⅲ）的含量。

1.4 體外配合物穩(wěn)定性測定[15]

配制 Gd（Ⅲ）的濃度為 2 mmol·L-1配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和 Gd-DTPA 溶液(含1%醋酸，0.9%NaCl水溶液)； 分別加入 Na2C2O4，終濃度為 20 mmol·L-1；混勻，37 ℃孵育 24 h；離心，取上清；加入高純濃硝酸室溫消解48 h，再加入質量分數(shù)為30%的H2O2室溫消解4 h，定容；用ICP-MS檢測溶液中Gd（Ⅲ）的含量。

1.5 體外馳豫性能研究

1.5.1 縱向弛豫率(r1)的測定

分別配制一系列不同濃度的配合物的水溶液，濃度分別為 0.0，0.4，0.8，1.2，1.6 和 2.0 mmoI·L-1。弛豫時間T1通過核磁共振與成像分析儀 (imaging&analyzing system)中的反轉恢復系列(inversionrecovery sequence)測得(32 ℃，3 T)。 r1(L·mmol-1·s-1)根據(jù)式：(1/T1)溶液=(1/T1)水+r1cM得到，cM為溶液中Gd（Ⅲ）的物質的量濃度(mmol·L-1)。

1.5.2 體外T1加權成像

體外T1加權成像通過成像分析儀 (imaging&analyzing system)中的多層自旋回波序列(Multiple spin echo sequence；MSE)測得，參數(shù)設置如下：重復時間TR=6000 ms，回波時間TE=7.2 ms，掃描次數(shù)NS=12， 層厚 Slice thickness=2.5 mm。將 2.0 mmol·L-1的配合物和作為對照的Gd-DTPA水溶液稀釋成濃度分別為 0.0，0.5，1.0，1.5 和 2.0 mmol·L-1濃度的溶液。體外T1加權成像信號值通過Image J軟件進行分析。

1.6 細胞毒活性測定

按照1×106cm-2的密度將HeLa細胞懸液接種于96孔板中，然后置37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞處于對數(shù)生長期，加入濃度梯度分別為：0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，80.0 μmoI·L-1的化合物。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入濃度為5 g·L-1的噻唑藍(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)20 μL，37 ℃孵育 4 h，棄去上清，加入150 μL 二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩10 min，用酶標儀測570 nm處溶液的吸光度。

1.7 細胞的攝取

MCF-7細胞用含10%胎牛血清 (Fetal Calf Serum，F(xiàn)BS) 的高糖 DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Medium)培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照密度 1×106cm-2接種于六孔板中，細胞處于對數(shù)生長期時，加入濃度為2 mmol·L-1不同配合物溶液 150 μL，使 Gd（Ⅲ）的濃度為 100 μmol·L-1。37 ℃，5%CO2的條件培養(yǎng)16 h。

細胞用胰酶消化液(0.25%，含0.02%EDTA)消化，用1×PBS緩沖液洗滌2次，棄去上清，得細胞沉淀，加入高純濃硝酸40 μL室溫消解48 h，再加入質量分數(shù)為30%的H2O240 μL室溫消解4 h，定容至1.5 mL，用ICP-MS檢測Gd（Ⅲ）的含量。

2 實驗結果

2.1 紅外光譜分析

NCMCS、DTPA-NCMCS 及 Gd-(DTPA-NCMCS)的紅外光譜圖如圖1所示。對比NCMCS與DTPANCMCS的圖譜，大多數(shù)吸收峰基本相似；DTPANCMCS圖譜中1 734 cm-1出現(xiàn)了羧酸根中羰基的伸縮振動峰，表明DTPA已被鍵合到NCMCS上。Gd-(DTPA-NCMCS)圖譜中 1 624 cm-1及 1 402 cm-1的吸收峰分別移到1 601 cm-1和1 384 cm-1處，說明DTPA-NCMCS與Gd（Ⅲ）形成了配位鍵。

圖1 原料NCMCS、配體DTPA-NCMCS及配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of NCMCS,DTPA-NCMCS and Gd-(DTPA-NCMCS)

圖2為一組與CS相關的紅外譜圖，DTPA-CS圖譜中羧酸根中羰基的伸縮振動峰在1 734 cm-1處，形成Gd-(DTPA-CS)配合物后，1 624 cm-1及1 402 cm-1的吸收峰分別移到1 594 cm-1和1 384 cm-1處。

圖2 原料CS、DTPA-CS及配合物Gd-(DTPA-CS)的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of CS,DTPA-CS and Gd-(DTPA-CS)

2.2 配合物中Gd（Ⅲ）含量的測定

用ICP-MS法測得配合物Gd-(DTPA-CS)中釓的含量達到22.38%，羧甲基殼聚糖配合物中配合物Gd-(DTPA-NCMCS)中釓的含量為12.83%。表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)中配體所占比例比配合物Gd-(DTPA-CS)中配體所占比例高，我們期望配合物分子量的增加會引起配合物縱向弛豫率的增加。

2.3 體外配合物穩(wěn)定性測定

草酸釓極難溶，被廣泛用于釓元素的萃取[16]。因此，我們將Na2C2O4與配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA在37℃孵育24 h后用ICP-MS測定配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPACS)和Gd-DTPA中Gd（Ⅲ）的濃度，發(fā)現(xiàn)其比反應前分別降低了(6.2±1.2)%，(6.8±1.8)%和(5.4±1.7)%。表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)在近生理條件下具有較大的穩(wěn)定性，可以進一步用于體內磁共振造影應用。

2.4 體外馳豫性能

2.4.1 縱向弛豫率(r1)的測定

弛豫率用來評價不同造影劑的信號增強能力，順磁性造影劑的質子弛豫性能通常通過縱向弛豫率r1來評價。配合物溶液的弛豫時間的倒數(shù)T1-1(s-1)與濃度(mmol·L-1)的線性關系如圖3所示，相關系數(shù)為0.999，表明兩者有很高的相關性。

圖3 配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及Gd-DTPA的T1-1與濃度之間的線性關系Fig.3 T1-1of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA vs the concentrations of the complexes

通過1.5.1中公式計算得到配合物Gd-(DTPANCMCS)、Gd-(DTPA-CS)和Gd-DTPA在水溶液中的縱向弛豫率r1，結果列于表1。從表中可以看出，Gd-(DTPA-NCMCS) 在水溶液中的 r1是 7.06 L·mmol-1·s-1Gd-(DTPA-CS)在水溶液中的 r1是 4.56 L·mmol-1·s-1，而 Gd-DTPA在水溶液中的 r1只有 3.01 L·mmol-1·s-1。從實驗結果可以看出，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)及Gd-(DTPA-CS)的r1值均高于商業(yè)化的MRI造影劑Gd-DTPA。根據(jù)文獻報導[17-18]，引起弛豫率增加的原因一般有如下幾種：(a)其他結構的引入增加了相對分子量，降低了分子的相關旋轉速率；(b)內層配位水分子的增加；(c)外層配位水分子的增加。配合物弛豫率的提高主要是由第一種因素引起的，因為-COOH向-CONH-或-COO-的轉變一般不會引起內層和外層水分子數(shù)目的變化。且配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)和 Gd-(DTPA-NCMCS)的結構相似，分子量大的Gd-(DTPA-NCMCS)縱向弛豫率r1更大。

表1 配合物Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及Gd-DTPA在水溶液中的縱向弛豫率r1Table 1 Longitudinal relaxation rate(r1)of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA in aqueous solution

2.4.2 體外T1加權成像

釓基功能配合物的體外T1加權成像效果通過不同濃度的圖像來表現(xiàn)。從圖中可以看出，隨配合物溶液濃度的增加，其體外成像的亮度逐漸增強。相同濃度下，Gd-(DTPA-NCMCS)與 Gd-(DTPA-CS)成像的亮度均大于Gd-DTPA，表明殼聚糖結構的引入大大降低了分子的相關旋轉速率，提高了造影劑的弛豫率和成像信號強度。在濃度為2.0 mmol·L-1時，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)成像亮度最強。換言之，要達到Gd-DTPA同等的成像亮度和對比度，使用配合物Gd-(DTPA-NCMCS)作為造影劑可以降低配合物用量，從而可提高其體內安全性。

圖4 配合物 Gd-(DTPA-NCMCS)、Gd-(DTPA-CS)及 Gd-DTPA在不同濃度條件下體外T1加權成像圖Fig.4 T1-weighted images in vitro vs concentrations of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA

2.5 配合物的生物相容性

進一步考察配合物的生物相容性，采用MTT法研究配合物對細胞的毒性。以HeLa細胞為作用對象。通過不同濃度的配合物作用于細胞，得到不同濃度下配合物對細胞的抑制率見表2，柱狀圖如圖5，擬合得到配合物Gd-(DTPA-CS)和Gd-(DTPANCMCS)的 IC50值(表)分別為 308.6 和 568.2 μmol·L-1。兩種配合物的IC50值均很大，表明這兩種配合物的毒性很低，可以作為潛在的磁共振造影劑。

圖5 配合物 Gd-(DTPA-CS)和 Gd-(DTPA-NCMCS)對HeLa細胞的毒活性(48 h)Fig.5 Cytotoxicity against HeLa cells of Gd-(DTPANCMCS)determined by MTT assay after 48 h

表2 配合物Gd-(DTPA-CS)和Gd-(DTPA-NCMCS)對HeLa細胞作用的IC50值Table 2 IC50against HeLa cells of Gd-(DTPA-CS)and Gd-(DTPA-NCMCS)

本實驗用ICP-MS測定了HeLa細胞中Gd的含量(表3)，結果說明修飾了殼聚糖和N-羧甲基殼聚糖的Gd-DTPA配合物進入細胞的量均比Gd-DTPA進入細胞的量多，尤其是Gd-(DTPA-NCMCS)進入細胞的量最多，達到 17.8 μg·L-1。 結果表明，達到相同的造影效果，配合物Gd-(DTPA-NCMCS)的使用量最低，從而可減少造影劑的毒性。

表3 用ICP-MS測定的HeLa細胞中的Gd含量Table 3 Cellular uptake of Gd-(DTPA-NCMCS),Gd-(DTPA-CS)and Gd-DTPA by HeLa cells in terms of Gd content determined by ICP-MS

3 結 論

綜上所述，本研究選擇具有優(yōu)良性能的N-羧甲基殼聚糖修飾DTPA，合成了配合物Gd-(DTPANCMCS)。該化合物具有以下優(yōu)良性能：(1)在生理條件下具有良好的穩(wěn)定性；(2)高弛豫性能，Gd-(DTPA-NCMCS)在水溶液中的r1高于臨床造影劑Gd-DTPA，且高于Gd-(DTPA-CS)。較高的弛豫率表明在較低的釓量下可以達到同等的MRI對比增強效果，從而可降低金屬離子在體內引發(fā)的毒性；(3)Gd-(DTPA-NCMCS)的低毒性和較高的細胞攝取率表明配合物Gd-(DTPA-NCMCS)有望成為性能優(yōu)良的新型MRI造影劑。

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