劉愛(ài)民，馮定山，張園園，盧存龍，曹圓圓

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué) 院，生態(tài)環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重要生物資源的保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

不同預(yù)處理方式對(duì)堿法提取米渣蛋白得率的影響

劉愛(ài)民，馮定山，張園園，盧存龍，曹圓圓

（安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué) 院，生態(tài)環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重要生物資源的保護(hù)與利用研究安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000）

研究不同的預(yù)處理方式對(duì)堿法提取米渣蛋白得率的影響。結(jié)果表明：分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸或稀釋20倍的醋酸（0.875 mol/L）對(duì)米渣在25 ℃處理180 min，再用0.1 mol/L NaOH溶液提取，溫度50 ℃，提取時(shí)間27 h，則蛋白提取率有較大提高；蛋 白質(zhì)提取率分別為84.60%和80.1%，高于未經(jīng)過(guò)酸處 理的米渣蛋白提取率。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%檸檬酸和 稀釋20 倍（0.875 mol/L）的醋酸預(yù)處理的大米渣蛋白質(zhì)經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，用體積分?jǐn)?shù)18%分離膠有利于蛋白質(zhì)電泳的分離；蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中分解成小的片段，主要集中在9.5 kD和4.1 kD附近，其中4.1 kD蛋白含量較多，且用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸預(yù)處理后堿法提取的蛋白質(zhì)顏色純白鮮亮，質(zhì)地細(xì)膩潤(rùn)滑。

大米渣；預(yù)處理；蛋白質(zhì)；提取率；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

大米蛋白是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白，大米含有8%蛋白，按其溶解性分為清蛋白﹑球蛋白﹑醇溶蛋白[1]和谷蛋白，其中谷蛋白占80%以上。由于大米蛋白含量低，直接從大米中提取蛋白質(zhì)的成本較高，經(jīng)濟(jì)性較差[2]。在以大米為原料發(fā)酵生產(chǎn)味精﹑葡萄糖等工業(yè)生產(chǎn)中僅用了大米中的淀粉，其中的大米蛋白沒(méi)能得到很好地利用。大米經(jīng)高溫液化和糖化后得到的米渣，蛋白質(zhì)含量約為50%，為原料大米蛋白質(zhì)含量的5～7 倍[3]，是制備大米蛋白的理想原料[4]。米渣蛋白是熱變性的大米蛋白，具有大米蛋白的一切優(yōu)點(diǎn)，及良好的氨基酸組成配比，含有機(jī)體所需的必需氨基酸，尤其賴氨酸，具有口感溫、低過(guò)敏性和降低膽固醇等優(yōu)點(diǎn)[5]，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，從米渣中制備大米蛋白更具經(jīng)濟(jì)性和實(shí)用性。大米蛋白主要是谷蛋白，在中性條件下溶解度較低，經(jīng)過(guò)高溫液化糖化后，米渣內(nèi)部的蛋白溶解度進(jìn)一步降低，限制了其在食品中的應(yīng)用[6]。近年來(lái)已開(kāi)始對(duì)米渣中蛋白質(zhì)的提取進(jìn)行研究，但由于米渣中蛋白質(zhì)的溶解性極差，采用傳統(tǒng)水溶液提取的方法很難將蛋白質(zhì)提取出來(lái)，因此需要增加米渣蛋白的溶解度[7-8]。目前米渣主要用作飼料原料，而作為飼料原料出售價(jià)格低，經(jīng)濟(jì)效應(yīng)不明顯[9]。

大米蛋白的制備主要有堿溶酸沉法﹑酶法﹑物理分離法和排雜法等[10]。采用堿溶酸沉法可提取得到純度相對(duì)較高的大米蛋白[11]，王亞林等[12]在pH 12、堿提2 h、溫度40 ℃，蛋白質(zhì)提取率可達(dá)49.9%，產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量為71.1%。酶法制備大米蛋白主要利用蛋白酶等對(duì)大米蛋白進(jìn)行降解和修飾，使其變成可溶性肽后被提取出來(lái)[13]。頓新鵬等[14]提出酶法水解米渣中蛋白質(zhì)制備小分子肽方法[15]，溫度50 ℃﹑時(shí)間6 h水解條件下，蛋白質(zhì)提取率能達(dá)63.4%。單純使用堿法或酶法存在優(yōu)劣，人們開(kāi)始考慮采用復(fù)合提取方法，既保證產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)率又盡可能地降低生產(chǎn)成本。陳季旺等[16]通過(guò)堿酶兩步法從碎米中提取大米蛋白，大米蛋白提取率可達(dá)到70.22%，純度為85.75%。排雜法是通過(guò)各種手段，盡量把各種非蛋白成分除去，最終獲得高純度的米渣蛋白。近幾年有利用發(fā)酵法提高大米蛋白純度的相關(guān)報(bào)道，紀(jì)鳳娣等[17]對(duì)以乳酸菌發(fā)酵提純大米蛋白的方法進(jìn)行了探討，并與水洗法和淀粉酶酶解法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，以乳酸菌發(fā)酵提純大米蛋白效果最好，大米蛋白由初始的65%提高到89%，雖然發(fā)酵制備的大米蛋白純度較高，但是發(fā)酵周期較長(zhǎng)。Liao等[18]用醋酸來(lái)處理小麥谷蛋白去酰胺化，使得酶解更容易，口味更接近谷蛋白且營(yíng)養(yǎng)更豐富。國(guó)內(nèi)對(duì)米渣蛋白在食品應(yīng)用的研究還處于初試階段，所以前景很廣闊[19-20]。

本實(shí)驗(yàn)采用大米渣為原料，在前人研究基礎(chǔ)之上，改進(jìn)方法，通過(guò)先弱酸處理后堿提取，使米渣蛋白改性，使之更易提取，提高其提取率和蛋白質(zhì)純度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米渣由某糖漿加工廠家提供大米渣干燥而成，其蛋白質(zhì)含量經(jīng)測(cè)定含量為58.2%。

氫氧化鈉（分析純）、95%乙醇（含量≥95%）無(wú)錫市展望化工試劑有限公司；冰乙酸（含量99.0%，17.5 mol/L） 上海試劑一廠綜合經(jīng)營(yíng)公司；三羥甲基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris，含量≥99.0%） 上海惠興生化試劑有限公司；無(wú)水檸檬酸（純度≥99.5%）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr，含量≥99.9%）、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（N,N’-methylene bis acrylamide，Bis，含量≥99.0%）、N,N,N,N,-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamin，TEMED，含量≥99.0%）、超低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Marker 4 100～66 000 D）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS，SB0485含量≥99.0%） 生工生物工程（上海）股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)R250 上?；瘜W(xué)試劑站分裝廠。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL80-2B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠制造；HWS-28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDN-O8消化爐 浙江托普儀器有限公司；Freezone 215L冷凍干燥機(jī) USA LABCONCO公司；SKY-2102C恒溫?fù)u床 上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；DYY-Ⅲ24型垂直電泳槽 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米渣常規(guī)成分含量的測(cè)定

蛋白含量的測(cè)定：凱氏定氮法（固體總蛋白）[21]和GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》方法；脂肪的測(cè)定：索氏抽提法[22]和GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測(cè)定》方法；還原糖和總糖的測(cè)定：DNS法[23]。

1.3.2 檸檬酸和醋酸對(duì)米渣蛋白預(yù)處理

米渣先經(jīng)過(guò)研磨處理，然后過(guò)100 目篩子處理，收集粒度為0.15 mm的米渣，稱取米渣分為11份，每份3 g于燒杯中，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%檸檬酸和稀釋0、2、5、10、20倍醋酸（即濃度為17.5、8.75、3.5、1.75、0.875 mol/L）各10 mL，另外一組作為對(duì)照不做任何預(yù)處理?；旌喜⑦m當(dāng)攪拌，在25 ℃條件下處理60、90、120、180、240 min等不同時(shí)間，再將米渣用紗布過(guò)濾去酸，置于65 ℃烘干米渣，取0.2 g加入0.1 mol/L NaOH溶液10 mL，放入50 ℃水浴鍋中慢慢攪拌均勻，處理27 h，使蛋白質(zhì)在堿性狀態(tài)下溶解。3 000 r/min離心20 min，分離去渣，取蛋白液加入0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)蛋白液至等電點(diǎn)4.0，4 ℃冰箱靜置一夜，蛋白質(zhì)沉淀完全后3 000 r/min離心10 min后分離，真空冷凍干燥即得成品，測(cè)定含量[19]。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

NaOH提取的蛋白質(zhì)液加酸中和至pH 7左右，吸取200 ?L放入離心管中，12 000 r/min離心10 min，吸取50 ?L與2 倍樣品緩沖液混合，100 ℃水浴10 min后立即上樣。

根據(jù)郭堯君[23]分別制備體積分?jǐn)?shù)12%、15%、18%分離膠和體積分?jǐn)?shù)5%濃縮膠，電泳上下槽倒入緩沖液，取出備用樣品，待溶化后12 000 r/min離心10 min后，微量注射器吸取15 ?L上樣，剛開(kāi)始100 V，待染色帶進(jìn)入分離膠后增加至120 V，當(dāng)染料帶抵達(dá)底部約1 cm處，電壓緩緩歸零，取出膠，左上角切一小塊以標(biāo)記樣品順序，考馬斯亮藍(lán)R250染色1 h左右，然后脫色2～3 h左右，直至背景清晰。

1.3.4 產(chǎn)品提取率的計(jì)算

式中：G為米渣蛋白得率/%；M為分離物中米渣蛋白的質(zhì)量/g；N為米渣中蛋白質(zhì)含量/g。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

Excel 2003分析和SPSS Statistics 19.0分析處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 米渣基本成分分析

表1 米渣基本成分Table1 Proximate composition of rice residue

米渣各成分含量如表1所示，米渣中蛋白的含量為58.2%，含量較高，是制備米渣蛋白的良好原料。米渣中除蛋白成分外，其非蛋白成分主要有糖、脂肪、纖維等。

2.2 不同預(yù)處理方式對(duì)米渣蛋白堿法提取率的影響

2.2.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸對(duì)米渣蛋白提取率的影響

取不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%處理180 min后的烘干米渣0.2 g，粒度為0.15 mm，加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其上清液等電點(diǎn)處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥后稱質(zhì)量。

圖1 檸檬酸質(zhì)量濃度對(duì)米渣蛋白質(zhì)堿法提取率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of citric acid on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由圖1可知，在檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%以下時(shí)，用堿法提取的大米渣蛋白質(zhì)提取率隨檸檬酸質(zhì)量濃度增加而逐漸升高，當(dāng)檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)0.5%后，蛋白質(zhì)提取率有下降趨勢(shì)。而用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸預(yù)處理后，蛋白質(zhì)提取率高達(dá)84.60%，比未用酸處理的米渣蛋白提取率高出38.60%。

2.2.2 檸檬酸預(yù)處理時(shí)間對(duì)米渣蛋白提取率影響

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸常溫處理60、90、120、180、240 min后，過(guò)濾去酸，烘干米渣，粒度為0.15 mm，取0.2 g加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其清液等電點(diǎn)處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥后稱質(zhì)量。

圖2 檸檬酸處理時(shí)間對(duì)米渣蛋白質(zhì)堿法提取率影響Fig.2 Effect of citric acid pretreatment time on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由圖2可知，在檸檬酸處理時(shí)間為180 min 處，蛋白質(zhì)提取率已經(jīng)達(dá)到最大值，為81.03%，此后隨處理時(shí)間增加，蛋白質(zhì)提取率增加并不明顯，這是因?yàn)闄幟仕崽幚頃r(shí)發(fā)生去酰胺反應(yīng)在180 min左右比較完全，有利于堿法提取蛋白質(zhì)。

2.2.3 醋酸濃度對(duì)米渣蛋白提取率的影響

取不同稀釋濃度醋酸處理180 min后的烘干米渣0.2 g，粒度為0.15 mm，加入0.1 mol/L NaOH溶液 10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其上清液等電點(diǎn)處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥后稱質(zhì)量。

圖3 不同濃度醋酸對(duì)米渣蛋白堿法提取率影響Fig.3 Effect of acetic acid at different concentrations on the efficiency of alkaline extraction of protein from rice residue

由圖3可以看出，經(jīng)過(guò)醋酸預(yù)處理的米渣蛋白提取率在80%左右，而未經(jīng)醋酸處理的米渣蛋白堿法提取率只有45.25%。由于醋酸對(duì)米渣蛋白有去酰胺作用，即酰胺基團(tuán)中的氨基變成高親水的羧基，分子內(nèi)氫鍵的減少和分子間靜電排斥的增加使米渣蛋白溶解性提高。但如果醋酸濃度太高，水洗時(shí)會(huì)浪費(fèi)大量水，且腐蝕儀器設(shè)備，稀釋20倍的醋酸處理后，蛋白質(zhì)提取率達(dá)80.10%，比未用酸處理的米渣蛋白提取率46%高出34.1%，比王亞林等[12]在pH 12、堿提2 h、溫度40 ℃，蛋白質(zhì)提取率49.9%，高出30%左右。

2.3 酸處理后堿提取的蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳

圖4顯示，用體積分?jǐn)?shù)為18%分離膠效果較好，SDS-PAGE電泳結(jié)果可以看出，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%檸檬酸和稀釋20 倍醋酸預(yù)處理后蛋白電泳相似，且譜帶清晰，但醋酸預(yù)處理蛋白電泳D部分電泳是獨(dú)有的，D部分條帶明顯小于4.1 kD。兩者A部分電泳條帶拖尾較嚴(yán)重，相對(duì)分子質(zhì)量集中在35～66 kD之間。B部分集中在6.5～9.5 kD（主要集中在9.5 kD附近），C部分蛋白集中在4.1 kD附近，含量較多，說(shuō)明大米渣的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)檸檬酸與醋酸處理后堿法提取對(duì)米渣蛋白有水解作用，在提取過(guò)程中米渣蛋白被分解成小片段或者亞基，這與王章存[4]測(cè)的米渣蛋白谷蛋白最低13 kD要小很多，說(shuō)明蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中分解了。另外提取米渣谷蛋白邊緣不太清晰，這是糖蛋白共同特征[23]。

圖4 酸預(yù)處理后提取的米渣蛋白的SDS-PAGE圖譜（18%分離膠）Fig.4 SDS-PAGE patterns of rice residue protein obtained with acid pretreatments (18% separating gel)

2.4 酸處理后堿提取米渣蛋白樣品圖

取酸處理后和未處理的烘干米渣各0.2 g，加入0.1 mol/L NaOH溶液10 mL攪勻，置于50 ℃水浴鍋中保溫27 h，離心取其清液等電點(diǎn)處沉淀米渣蛋白，冷凍干燥。

圖5 不同預(yù)處理大米渣蛋白樣品Fig.5 Rice residue protein samples after different pretreatments

從圖5可以看出，圖5d原料大米渣，未過(guò)篩，樣品粗糙，色澤黃；而圖5a中用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸預(yù)處理后再堿法提取的米渣蛋白色澤純白，細(xì)膩潤(rùn)滑，質(zhì)地較好；圖5c為稀釋20倍（0.875 mol/L）醋酸預(yù)處理后再堿法提取的米渣蛋白，色澤有點(diǎn)偏黃；圖5b為未用酸處理而直接用堿法提取的米渣蛋白。由此可見(jiàn)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸預(yù)處理米渣后對(duì)堿法提取米渣蛋白的樣品顏色有增白效果，產(chǎn)品質(zhì)量較高。

3 結(jié) 論

通過(guò)分析不同預(yù)處理方式對(duì)堿提取米渣蛋白率影響可知：先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%檸檬酸或稀釋20倍（0.875mol/L）的醋酸對(duì)米渣蛋白25 ℃預(yù)處理180 min，然后用0.1 mol/L NaOH溶液、50 ℃提取27 h，米渣蛋白提取率大幅度提高，分別為84.60%和80.1%，比未用酸處理的米渣蛋白提取率46%分別高出38.60%和34.1%。而質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%檸檬酸處理后米渣提取蛋白顏色純白，細(xì)膩潤(rùn)滑，質(zhì)地較好。此法尚未見(jiàn)報(bào)道，產(chǎn)品質(zhì)地也優(yōu)于目前已報(bào)道的。

SDS-PAGE凝膠電泳分析表明，酸處理后堿法提取的米渣蛋白主要集中在9.5 kD和4.1 kD左右，其中4.1 kD蛋白含量較多，蛋白質(zhì)在提取過(guò)程中分解成較小的片段。

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Effect of Different Pretreatments on the Efficiency of Alkaline Extraction of Protein from Rice Residue

LIU Ai-min, FENG Ding-shan, ZHANG Yuan-yuan, LU Cun-long, CAO Yuan-yuan
(College of Life Sciences, Key Laboratories of Biotic Environment and Ecological Safety, Conservation and Utilization of Biological Resource in Anhui Province, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

In this study, experiments were conducted to examine the effect of different pretreatments on the extraction efficiency of protein from rice residue using alkaline. The results showed the extraction efficiency of protein was increased largely compared to that without pretreatment, reaching 84.60% and 80.1%, respectively, when rice residue was soaked for 180 min in 0.5% citric acid or 0.875 mol/L acetic acid at 25 ℃ before being extracted at 50 ℃ for 27 h with 0.1 mol/L NaOH. The rice proteins extracted from both pretreated samples were could be effectively separated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with 18% separating gel. During the extraction process, rice proteins were decomposed into fragments mostly having a molecular weight around 9.5 or 4.1 kD, especially around the smaller molecular weight. Moreover, the rice residue protein obtained with 0.5% citric acid pretreatment had a bright purewhite color and a smooth and delicate texture.

rice residue; pretreatment; protein; extraction efficiency; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Q819

A

1002-6630（2014）10-0103-04

10.7506/spkx1002-6630-201410019

2013-10-12

2012年度安徽師范大學(xué)創(chuàng)新基金項(xiàng)目（2012cxjj04）；農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（2013006）；2012年度教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（20123424110004）；2012年度國(guó) 家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201210370089）；2014年度安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（1408085MC53）

劉愛(ài)民（1968—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称芳庸べY源化利用。E-mail：amliu9393@163.com