楊子琴，陳星星，李松剛，洪繼旺，張蕾

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝園林系，鄭州 451450）

龍眼成花與抗氧化防御體系關(guān)系研究

楊子琴1，陳星星2，李松剛1，洪繼旺1，張蕾1

（1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院園藝園林系，鄭州 451450）

以石硤龍眼為材料，通過(guò)低溫誘導(dǎo)、氧化脅迫、自然低溫+藥劑處理試驗(yàn)，探討龍眼成花和抗氧化防御之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，氧化脅迫處理或低溫+NO/H2O2促進(jìn)劑處理均有利于龍眼早花。NO促進(jìn)劑可抑制成花后期龍眼頂芽POD活性，H2O2清除劑可促使POD和SOD活性大幅上升，表明氧化脅迫信號(hào)正調(diào)控龍眼成花，而氧化防御體系負(fù)調(diào)控龍眼成花。

龍眼；成花；低溫誘導(dǎo)；氧化脅迫；氧化防御

龍眼（Dimocarpus longanLoureiro）正常情況下（即正造龍眼）成花需經(jīng)冬季低溫誘導(dǎo)，但龍眼可在非花季通過(guò)催花藥劑處理誘導(dǎo)成花，并形成產(chǎn)量，使經(jīng)典花芽分化理論面臨新挑戰(zhàn)。誘導(dǎo)成花藥劑中含有強(qiáng)氧化劑氯酸鉀，會(huì)造成脅迫。對(duì)于龍眼而言，低溫誘導(dǎo)以及氧化脅迫存在共同特征——都會(huì)導(dǎo)致活性氧累積，使植物處于脅迫狀態(tài)[1-2]。

活性氧信號(hào)在調(diào)節(jié)植物發(fā)育和應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)方面具有重要作用，但活性氧如何調(diào)節(jié)花芽分化則鮮有報(bào)道。Lokhande等發(fā)現(xiàn)，擬南芥開(kāi)花前抗壞血酸過(guò)氧化物酶活性越高，其開(kāi)花越遲；氧化脅迫越強(qiáng)，則開(kāi)花越早。為此，提出活性氧是誘導(dǎo)開(kāi)花的一個(gè)因子[3]；另有證據(jù)表明，活性氧的形成與花發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的上調(diào)有關(guān)[4]。Zafra等發(fā)現(xiàn)油橄欖成花過(guò)程有賴于H2O2的參與[5]。由此推測(cè)，活性氧可能也參與龍眼成花調(diào)控。但環(huán)境脅迫所誘導(dǎo)氧化脅迫及氧化防御信號(hào)在龍眼成花中的作用，尚待進(jìn)一步探索。本研究立足龍眼正造及反季節(jié)成花的實(shí)際情況，針對(duì)脅迫在龍眼成花中的作用，通過(guò)脅迫信號(hào)的發(fā)生、促進(jìn)及阻斷措施，探討脅迫所產(chǎn)生的抗氧化防御體系與成花之間的關(guān)系，旨在挖掘龍眼成花的誘導(dǎo)機(jī)理，同時(shí)為其他熱帶果樹(shù)周年生產(chǎn)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為8年生石硤龍眼（Dimocarpus lon?ganLoureiro）植株。

1.2 試驗(yàn)方法

人工低溫脅迫：采用低溫/高溫，即8～10℃（12 h）/18～22℃（12 h），光照模擬自然光，在末次冬梢成熟后進(jìn)行人工低溫誘導(dǎo)，脅迫后42 d側(cè)花原基形成。低溫誘導(dǎo)試驗(yàn)系統(tǒng)以單株為試驗(yàn)單元，5次重復(fù)。每隔7 d采集樣品（葉片與頂芽）1次。

氧化脅迫：采用正造季節(jié)摘除花序的龍眼樹(shù)（在正常開(kāi)花時(shí)摘除花序，以保證龍眼在催花時(shí)能蓄積足夠養(yǎng)分），在新梢抽生3次后進(jìn)行催花，催花藥劑為：土施氯酸鉀+氯化鉀，誘導(dǎo)成花（w氯酸鉀∶w氯化鉀=6∶4，0.5 kg·m-1樹(shù)冠直徑），催花后28 d側(cè)花原基形成。氧化脅迫試驗(yàn)以單株為試驗(yàn)單元，5次重復(fù)。每隔7 d采集樣品（葉片與頂芽）1次。

藥劑處理：冬季自然低溫下，龍眼樹(shù)末次冬梢成熟后20 d，對(duì)梢芽噴施藥劑，以單株為試驗(yàn)單元，5次重復(fù)。每種藥劑處理對(duì)每株樹(shù)噴施15個(gè)枝梢，每天采集樣品（頂芽）1次，至側(cè)花原基形成為止。藥劑處理包括：ABA 100 mg·L-1；ABA阻斷劑—鎢酸鈉（STD）5 mmol·L-1；H2O2清除劑—二甲基硫脲（DMTU）1 g·L-1；H2O2發(fā)生劑—百草枯（MV） 20 mg·L-1；NO發(fā)生劑—硝普酸鈉（SNP）0.1 mmol·L-1；NO合酶抑制劑（L-NNA）0.1 mmol·L-1；以噴施水為對(duì)照。

SOD和POD活性測(cè)定：酶液提取參照李玲方法[6]；SOD活性測(cè)定參照李合生方法[7]；POD活性測(cè)定參照高俊鳳方法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑處理對(duì)龍眼成花的效果分析

施藥12 d后，各藥劑處理間表現(xiàn)出很大差異：SNP、MV和ABA可顯著促進(jìn)龍眼形成早花，而L-NNA及DMTU對(duì)龍眼成花有抑制作用，STD對(duì)龍眼成花影響不顯著（見(jiàn)圖1）。

2.2 龍眼成花與SOD活性的關(guān)系

在人工低溫誘導(dǎo)情況下，龍眼葉片和頂芽均出現(xiàn)SOD活性的上升高峰，且頂芽出峰時(shí)間早于葉片。在冬季末梢成熟時(shí)，葉片SOD活性為130.13 U·g-1，隨后活性變化并不大，直至蟹眼期（枝梢成熟后42 d）葉片中SOD活性突然出現(xiàn)上升并達(dá)到峰值（430.37 U·g-1），隨后迅速下降到枝梢成熟時(shí)水平。頂芽SOD活性較葉片略高，在枝梢成熟時(shí)頂芽中SOD活性為196.51 U·g-1，在枝梢成熟后14 d達(dá)到高峰572.30 U·g-1；并在枝梢成熟后小幅下降到401.70 U·g-1，隨后下降到枝梢成熟初期水平（見(jiàn)圖2）。由此推測(cè)，在龍眼成花前期，葉片中有穩(wěn)定自由基產(chǎn)生，而在側(cè)花原基形成時(shí)（42 d）葉片不需要豐富的自由基。頂芽在誘導(dǎo)初期，迅速出現(xiàn)SOD分解自由基，但在側(cè)花原基形成前后SOD活性降低，可能是為頂芽聚集自由基做準(zhǔn)備。

氧化脅迫龍眼催花后，葉片SOD活性變化并不大，徘徊在82.90～142.61 U·g-1；但是頂芽SOD活性出現(xiàn)上升，由催花之前的209.07 U·g-1上升到304.12 U·g-1（7 d），側(cè)花原基形成時(shí)（28 d）下降到催花前水平。在氧化脅迫龍眼側(cè)花原基形成前，頂芽的SOD活性始終高于葉片（見(jiàn)圖3）。可見(jiàn)，龍眼成花過(guò)程中，在脅迫環(huán)境形成初期，SOD活性在頂芽迅速上升，并在側(cè)花原基形成之時(shí)下降到脅迫前水平。因此，可以推測(cè)植物在應(yīng)對(duì)外界脅迫時(shí)會(huì)打破植物體固有的酶平衡，而在側(cè)花原基形成前后，由于需要自由基刺激頂芽成花，故SOD活性恢復(fù)到脅迫前水平，有利于脅迫狀態(tài)下自由基的增加。

圖1 不同藥劑處理對(duì)龍眼成花的效果Fig.1 Effect of different agents treatments on longan flower

圖2 低溫誘導(dǎo)龍眼樹(shù)成花過(guò)程中SOD活性的變化Fig.2 Changes of SOD activity in various parts of low temperature induced longan trees during flower bud formation

圖3 氧化脅迫龍眼樹(shù)成花過(guò)程中SOD活性的變化Fig.3 Changes of SOD activity in various parts of oxidative stress longan trees during flower bud formation

ABA、H2O2、NO為脅迫環(huán)境下誘發(fā)的信號(hào)物質(zhì)，為探究ABA、H2O2、NO信號(hào)在龍眼成花過(guò)程中的作用，試驗(yàn)中采用信號(hào)加強(qiáng)和信號(hào)清除劑手段，從正反兩方面驗(yàn)證其在成花過(guò)程中的作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，在藥劑處理之后均誘發(fā)SOD活性迅速上升，尤其以DMTU和SNP最為明顯（見(jiàn)圖4）。DMTU處理可顯著增加頂芽SOD活性，由處理前的149.57 U·g-1上升至674.92 U·g-1，隨后下降，并在側(cè)花原基形成時(shí)（7 d）再次上升至高峰686.89 U·g-1；SNP處理導(dǎo)致頂芽SOD活性由初期的149.57 U·g-1上升至498.85 U·g-1，隨后下降，與DMTU有相同趨勢(shì)，在側(cè)花原基形成時(shí)（7 d）再次上升至高峰472.70 U·g-1；STD處理后導(dǎo)致頂芽SOD活性小幅上升，僅由149.57 U·g-1上升至252.07 U·g-1，隨后下降至111.64 U·g-1，低于5 d時(shí)對(duì)照水平（177.42 U·g-1）；ABA在處理1 d后頂芽SOD活性即上升至367.27 U·g-1，隨后下降至與對(duì)照相似水平；MV處理同樣造成龍眼頂芽SOD活性迅速上升至430.01 U·g-1，隨后下降至300.12 U·g-1，并在側(cè)花原基形成前（處理后5 d）再次上升；L-NNA處理1 d后導(dǎo)致龍眼頂芽SOD活性上升至413.89 U·g-1，隨后下降，并在側(cè)花原基形成時(shí)再次上升至372.49 U·g-1（見(jiàn)圖4）。

圖4 低溫誘導(dǎo)龍眼樹(shù)成花過(guò)程中不同藥劑處理對(duì)SOD活性的影響Fig.4 Effects of different agents treatments on SOD activity in bud of low temperature induced longan trees after during flower bud formation

龍眼頂芽對(duì)氧自由基的感應(yīng)量應(yīng)有一定適應(yīng)范圍，因此在應(yīng)對(duì)不同藥劑處理后，表現(xiàn)出不同的SOD活性變化，其中尤以H2O2清除劑處理后對(duì)SOD活性影響最大，這可能是由于外施DMTU導(dǎo)致H2O2銳減，而龍眼成花需要較多H2O2，因此SOD活性增強(qiáng)分解了自由基，并實(shí)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)變向H2O2發(fā)生。而NO發(fā)生劑SNP處理也導(dǎo)致SOD活性的上升，這可能是由于NO在H2O2脅迫信號(hào)通路的上游，NO對(duì)H2O2的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用。SNP處理導(dǎo)致NO大量產(chǎn)生，從而促進(jìn)其下游氧自由基的量相應(yīng)增加，因而誘發(fā)SOD活性上升，進(jìn)而降低自由基在組織中的含量。

2.3 龍眼成花與POD活性的關(guān)系

在成花過(guò)程中，低溫誘導(dǎo)龍眼各部位POD活性表現(xiàn)不同，葉片POD活性遠(yuǎn)低于頂芽活性（見(jiàn)圖5）。在整個(gè)花芽發(fā)育過(guò)程中，葉片POD活性變化不大，徘徊在273.16～557.16 U·g-1，枝梢成熟時(shí)葉片POD活性為340.26 U·g-1，并在側(cè)花原基形成之前上升至最高活性557.16 U·g-1；在枝梢成熟時(shí)（0 d），頂芽POD活性為1 264.23 U·g-1，在枝梢成熟后14 d跌進(jìn)低谷（546.43 U·g-1），并在枝梢成熟后21 d再次上升（1 160.94 U·g-1），隨后在側(cè)花原基形成時(shí)（42 d）再次跌到低谷（544.96 U·g-1）。

圖5 低溫誘導(dǎo)龍眼樹(shù)成花過(guò)程中POD活性的變化Fig.5 Changes of POD activity in various parts of low temperature induced longan trees during flower bud formation

氧化脅迫龍眼催花之前，葉片中POD活性高于頂芽。催花之后，葉片中POD活性迅速下降，由催花前的716.12 U·g-1下降到386.83 U·g-1，并在21 d跌至低谷（188.58 U·g-1）；頂芽中POD活性在催花后變化不大，始終在316.13～442.52 U·g-1上下波動(dòng)（見(jiàn)圖6）。

圖6 氧化脅迫龍眼樹(shù)成花過(guò)程中POD活性的變化Fig.6 Changes of POD activity in various parts of oxidative stress longan trees during flower bud formation

藥劑處理1 d后，除STD處理之外，其他各處理均導(dǎo)致POD活性上升，尤以SNP處理在施藥1 d后的活性上升幅度最大，達(dá)954.71 U·g-1；施藥3 d后，STD、ABA、L-NAA的POD活性均與對(duì)照相持平（443.87 U·g-1），此時(shí)SNP處理POD活性為636.59 U·g-1，DMTU處理為686.61 U·g-1，MV處理為523.71 U·g-1；施藥5 d后，仍以SNP、DMTU處理POD活性最高，分別達(dá)727.16和751.90 U·g-1，其他處理均略高于對(duì)照水平（516.01 U·g-1）；而在施藥7 d后，DMTU、ABA和L-NNA的POD活性最高，分別達(dá)641.78、609.16和647.64 U·g-1其次為SNP、STD及MV，有相近POD活性，分別為484.97、430.48和480.68 U·g-1，均高于對(duì)照的262.74 U·g-1（見(jiàn)圖7）。

圖7 低溫誘導(dǎo)龍眼樹(shù)成花過(guò)程中不同藥劑處理對(duì)POD活性的影響Fig.7 Effects of different agents treatments on POD activity in bud of low temperature induced longan trees during flower bud formation

前期試驗(yàn)已證實(shí)頂芽在龍眼成花過(guò)程中對(duì)氧自由基的含量有較高要求，而其精密的調(diào)控模式也絕非SOD一種酶可獨(dú)立完成。通過(guò)加強(qiáng)NO信號(hào)的手段發(fā)現(xiàn)POD活性劇烈上升，而POD的作用為催化H2O2形成H2O和O2。因此，進(jìn)一步確定NO在H2O2脅迫信號(hào)通路的上游調(diào)控龍眼成花。

3 討論與結(jié)論

3.1 脅迫信號(hào)與龍眼成花

環(huán)境脅迫會(huì)干擾細(xì)胞正常代謝，誘發(fā)活性氧（ROS）積累，產(chǎn)生氧化脅迫。因而，氧化脅迫是次級(jí)脅迫，是環(huán)境脅迫共有的組成部分[9]；而植物對(duì)氧化脅迫適應(yīng)能力是其種群延續(xù)的重要部分[10]。本研究發(fā)現(xiàn)任何氧化脅迫產(chǎn)物或產(chǎn)物促進(jìn)劑處理，均可導(dǎo)致龍眼早花，氧化脅迫阻斷劑處理可導(dǎo)致龍眼成花延遲。這說(shuō)明H2O2、NO參與龍眼成花信號(hào)調(diào)控過(guò)程，與Zhou等荔枝研究結(jié)果相同[11]。

3.2 SOD活性變化與龍眼成花

SOD主要功能是清除超氧陰離子自由基（O2-·），并防御活性氧或其他過(guò)氧化物自由基對(duì)細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，減少自由基對(duì)有機(jī)體的毒害。擬南芥晚花突變體的保水能力和SOD活性均高于野生型，說(shuō)明SOD活性越高開(kāi)花越晚[10]，與本研究結(jié)果一致，在龍眼成花過(guò)程中，經(jīng)DMTU處理的龍眼頂芽SOD活性遠(yuǎn)高于MV處理，表現(xiàn)為SOD活性與龍眼成花呈負(fù)相關(guān)，SOD在成花中作用有賴于其對(duì)頂芽中H2O2調(diào)控實(shí)現(xiàn)。

3.3 POD活性變化與龍眼成花的關(guān)系

植物細(xì)胞內(nèi)存在的清除自由基的酶保護(hù)系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、POD，該系統(tǒng)的SOD能夠歧化超氧化物陰離子自由基（O2-·），而POD和CAT則催化H2O2形成H2O和O2。SOD、CAT、POP的協(xié)同作用可降低氧自由基的積累及阻礙自由基（O2-·）、H2O2向破壞性極強(qiáng)的-OH轉(zhuǎn)化，避免或減輕自由基對(duì)生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)等的降解破壞，對(duì)生物膜損傷[12]。SNP處理導(dǎo)致NO大量產(chǎn)生，導(dǎo)致H2O2的量驟增，進(jìn)而誘發(fā)POD活性上升，分解H2O2。

綜上，認(rèn)為H2O2和NO在龍眼成花過(guò)程中具有重要作用，NO在H2O2上游調(diào)節(jié)龍眼成花，但其深層作用機(jī)理有待深入研究。

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Relationship between longan flower and oxidative defense system

YANG Ziqin1,CHEN Xingxing2,LI Songgang1,HONG Jiwang1,ZHANG Lei1
(1.Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China,Danzhou Hainan 571737,China;2. Department of Horticulture,Henan Vocational College ofAgriculture,Zhengzhou 451450,China)

To study whether a correlation exists between longan flower and oxidative defense,low temperature induction,oxidative stress,natural low temperature combined medicament spraying in‘shixia’longan buds and leaves were tested.The results showed that oxidative stress and low temperature combined NO/H2O2generator treatment displayed significantly effect to longan early flower.NO promoter could inhibit POD activity of longan buds in the late flower period,and H2O2scavenger treatment had led to a POD and SOD activity increased sharply.All the results showed that longan flower signals were positive regulated by oxidative stress,and oxidative defense system negative regulation of longan flowers.

longan;flower;low temperature induction;oxidative stress;oxidative defense

S667.2

A

1005-9369（2014）11-0037-06

2014-05-13

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（1630032014017）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CARS-33-25）

楊子琴（1981-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)楣麡?shù)栽培生理。E-mail:yangziqin1@163.com

時(shí)間2014-11-21 16:42:32[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141121.1642.013.html

楊子琴,陳星星,李松剛,等.龍眼成花與抗氧化防御體系關(guān)系研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(11):37-42.

YANG Ziqin,CHEN Xingxing,LI Songgang,et al.Relationship between longan flower and oxidative defense system[J]. Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(11):37-42.(in Chinese with English abstract)