劉寧，張振，任皓威，何揚波，曹宇彤，譚居中，李賀佳

（1.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

氣相色譜法測定牛乳脂肪酸前處理方法的優(yōu)化

劉寧1,2，張振1,2，任皓威1,2，何揚波1,2，曹宇彤1,2，譚居中1,2，李賀佳1,2

（1.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030）

優(yōu)化氣相色譜法測定牛乳脂肪酸時甲酯化處理方法的條件。利用氨水-乙醇法提取牛乳中脂肪，通過不同條件下各因素試驗和響應面分析，使脂肪酸甲酯化的參數(shù)最佳，測定甲酯化前后脂肪酸酸值，計算甲酯化率。經(jīng)回歸分析確定脂肪酸甲酯化的最優(yōu)條件為：反應時間為23.05 min，反應溫度為84.24℃，KOH-甲醇的添加量為2.23 mL，三氟化硼-甲醇添加量為1.13 mL，在此條件下牛乳脂肪酸甲酯化率達到99.2%。比未優(yōu)化前脂肪酸甲酯化率明顯提高，且節(jié)省樣品和試劑，對牛乳脂肪酸準確定性定量分析具有重要意義。

氣相色譜；脂肪酸；甲酯化；響應面

牛乳最主要的脂質(zhì)成分是甘油三酯，約占脂質(zhì)97%～98%，由三分子脂肪酸和一分子甘油酯化構(gòu)成[1]。在脂肪酸分析時一般不直接進行氣相色譜分析，因為脂肪酸特別是長鏈脂肪酸沸點高、在高溫下不易揮發(fā)、檢測時柱溫高、脂肪酸難分離，對脂肪酸定性和定量測定均有干擾，因此，在脂肪酸分析時一般都要進行前處理，即脂肪酸衍生化[2]。脂肪酸衍生化方法分為堿催化[3]、酸催化[4]和酶法催化[5]等。脂肪酸甲酯一般通過堿性或者酸性方法衍生化而成，其中堿法催化更適合脂肪酸甘油酯的甲酯化，酸法催化更適合游離脂肪酸甲酯化。氣相色譜-氫火焰離子檢測器（GCFID）是脂肪酸組成分析最常用的方法[6-7]，通常分析前，脂肪酸需要轉(zhuǎn)換為其衍生物—脂肪酸甲酯，使其變成低沸點易揮發(fā)汽化的物質(zhì)。近年來，國內(nèi)外研究對不同的脂肪酸衍生化方法多有報道，陳煒等利用堿催化法分析德昌水牛乳脂肪酸組成[8]，Burdge等采用硫酸-甲醇法甲酯化脂肪酸[9]，然后再對脂肪酸進行分析，而在測定牛乳脂肪中脂肪酸時一般常用堿催化即氫氧化鉀-甲醇法，該法所用氫氧化鉀-甲醇量、酯化溫度、酯化時間及BF3-甲醇量都將對衍生化結(jié)果產(chǎn)生影響。雖然許多研究都描述了氫氧化鉀-甲醇法衍生化脂肪酸，但與現(xiàn)有方法相比較均無相統(tǒng)一的甲酯化條件，并且現(xiàn)有方法與相關(guān)文獻中甲酯化時間稍短、溫度偏高以及試劑添加量大，經(jīng)預試驗后發(fā)現(xiàn)并不是牛乳脂肪酸分析時的最佳條件。

為更加合理準確地定量定性分析牛乳脂肪酸，本研究對氣相色譜法分析脂肪酸時衍生化方法的甲酯化時間、甲酯化溫度、KOH-甲醇加入量和三氟化硼-甲醇加入量對脂肪酸甲酯化率的影響進行考查，應用響應面分析法優(yōu)化脂肪酸甲酯化法的條件，并據(jù)此對牛乳樣品中脂肪酸進行甲酯化率測定和比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳采自黑龍江完達山牧場；三氟化硼由阿法埃莎化學有限公司生產(chǎn)；氨水由固安縣清遠化工廠生產(chǎn)；無水乙醇、乙醚、石油醚均由天津市天力化學試劑有限公司生產(chǎn)；甲醇由天津市富宇精細化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平由梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)；離心機由上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)；氮吹儀由奧特賽思儀器有限公司生產(chǎn)；漩渦振蕩器由上海琪特分析儀器有限公司生產(chǎn)；水浴鍋由天津奧特賽斯儀器有限公司生產(chǎn)；抽提瓶由黑龍江省盛達生物試劑有限公司生產(chǎn)；氣相色譜7890A由美國安捷倫公司生產(chǎn)。

1.3 牛乳脂肪的提取

稱取牛乳樣1.0 g，加入0.2 mL氨水，于65℃水浴鍋中放置15 min，取出輕搖，冷卻至室溫。在制備好的樣品中加入1 mL無水乙醇，混勻。加入2.0 mL乙醚，加塞振搖1 min。加入2.0 mL石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機層轉(zhuǎn)入10 mL螺口玻璃管中。再加入2.0 mL乙醚及2.0 mL石油醚，加塞振搖1 min，靜置、分層，有機層轉(zhuǎn)入螺口玻璃管，加1.0 mL乙醚及1.0 mL石油醚重復操作一次。合并抽提液于螺口玻璃管中，氮吹儀吹干，得到牛乳脂肪濃縮物[10]。

1.4 甲酯化率的測定

1.4.1 酸值的測定

酸值測定方法參見文獻[11]。

1.4.2 計算甲酯化率

甲酯化率（%）＝（Av1-Av1）/Av1×100%；其中，Av1—樣品反應前酸值；Av2—樣品酯化一定時間后酸值。

1.5 試驗因素選擇

往1.3提取的乳脂質(zhì)中加入氫氧化鉀-甲醇溶液（0.5、1、1.5、2、2.5 mL）置于水?。?0、60、70、80、90℃）上回流到油滴消失。再加入三氟化硼-甲醇溶液（0、0.5、1、1.5、2 mL），繼續(xù)回流（5、10、15、20、25、30 min），冷卻至室溫，將磨口玻璃管中的液體移入10 mL離心管中，分別用0.3 mL飽和氯化鈉溶液清洗磨口玻璃管三次，合并飽和氯化鈉溶液于10 mL離心管，加入1 mL正己烷，振搖后，以5 000 r·min-1離心5 min，取上清液作為試液，供氣相色譜儀。每個水平重復3次，選出反應溫度（A）、時間（B）、KOH-甲醇量（C）和催化劑量（D）為影響甲酯化率的最主要因素。

1.6 試驗設(shè)計

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選取反應溫度（A）、時間（B）、KOH-甲醇量（C）和催化劑量（D）4個對脂肪酸甲酯化有顯著影響的因素，采用四因素三水平的響應面分析方法確定最佳脂肪酸甲酯化條件，試驗設(shè)計因素與水平見表1。

表1 試驗因素水平編碼表Table 1 Encode table of factors and levels

1.7 數(shù)據(jù)分析

各樣品均進行3次平行試驗，采用Design Ex?pert 7.0.0，Origin8.5.1，SPSS17.0等軟件對各樣品進行統(tǒng)計分析，所有試驗數(shù)據(jù)取平行試驗平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同條件下各因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 酯化時間的選擇對甲酯化率的影響

隨著時間的延長，酯化率不斷提高，當?shù)竭_20 min后，酯化率趨于平衡，之后略有降低。所以，由圖1可知應選擇20 min酯化時間，保持最高的甲酯化率。但延長反應時間有可能使牛乳脂肪酸氧化，且耗時耗能。

圖1 反應時間對甲酯化率的影響Fig.1 Effect of reaction time on methyl esterification rate

2.1.2 酯化溫度的選擇對甲酯化率的影響

隨著溫度的升高，酯化率不斷提高，當溫度到達80℃后，酯化率趨于平衡達到最大，之后隨著溫度增加酯化率開始下降，可能是由于溫度過高使脂肪酸氧化或異構(gòu)化。由圖2可知，所以，應選擇80℃的溫度，保持最高的甲酯化率。

2.1.3 KOH-甲醇量的選擇對甲酯化率的影響

隨著KOH-甲醇量的增加，脂肪酸的酯化率不斷增加，當KOH-甲醇量增加到2 mL時，脂肪酸甲酯化率達到最高，再增加KOH-甲醇量，脂肪酸酯化率有所下降。這是因為，添加KOH-甲醇量過多時，部分已生成的脂肪酸甲酯在堿性條件下再次水解。結(jié)果如圖3所示。

圖2 反應溫度對甲酯化率的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on methyl esterification rate

圖3 KOH-甲醇對甲酯化率的影響Fig.3 Effect of KOH-methanol on methyl esterification rate

2.1.4 催化劑量的選擇對甲酯化率的影響

結(jié)果見圖4。

圖4 催化劑對甲酯化率的影響Fig.4 Effect of catalyst on methyl esterification rate

由圖4可知，在不添加催化劑時，脂肪酸酯化率很低，在催化劑后脂肪酸酯化率迅速增加，催化劑添加量為1 mL時，脂肪酸甲酯化率達到最大，再添加催化劑脂肪酸酯化率不再增加反而有所下降，這是因為催化劑用量過多會發(fā)生皂化反應，因此，本試驗選用催化劑用量為1 mL。

2.2 脂肪酸甲酯化條件的優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗結(jié)果分析

在預試驗的基礎(chǔ)上，以脂肪酸甲酯化率作為響應值，對影響脂肪酸甲酯化的主要條件，反應時間（A）、反應溫度（B）、KOH-甲醇量（C）、催化劑量（D）等因素進行優(yōu)化，根據(jù)文獻[12-13]進行Box-Behnken的四因素三水平響應面試驗設(shè)計。響應面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型及方差分析

利用Design Expert 7.0.0軟件，對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到牛乳脂肪酸甲酯化率的回歸模型方程：Y=98.01+2.42A+3.18B+0.83C+0.40D+ 0.73AB+0.47AC+0.027AD-0.19BC-0.14BD-0.45CD-4.67A2-3.92B2-1.67C2-0.48D2。

表2 牛乳脂肪酸甲酯化影響因素響應面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface methodology for the conditions of fatty acid methyl ester process of bovine milk

對該回歸模型進行方差分析，由表3方差分析可知，模型P值<0.0001，說明所選用的二次多項模型極顯著，即試驗方法可靠；失擬項不顯著，且該回歸模型R2=0.9688，說明該回歸方程與試驗擬合良好，自變量與響應值之間線性關(guān)系顯著，因此可用該回歸方程代替試驗真實值對對試驗結(jié)果進行分析；該回歸模型的相對標準偏差為1.05%遠低于10%，說明該試驗具有良好穩(wěn)定性。

通過比較回歸模型各因素的F值大小，可以判斷影響牛乳脂肪酸甲酯化率的主要因素依次是B> A>C>D，即反應溫度>反應時間>KOH-甲醇量>催化劑量。

表3 牛乳脂肪酸甲酯化影響因素試驗方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis about the conditions of fatty acid methyl ester process for bovine milk

2.2.3 各因素間交互作用分析

為形象描述各因素間交互作用對響應值的影響，圖5給出各因素交互作用對酯化率影響的響應面。響應曲面坡度趨于陡峭，表明響應值對試驗條件改變非常敏感，相反如果響應曲面坡度相對平緩，說明試驗條件改變對響應值的影響較小。a～f直觀反映了所建立模型各因素交互作用對甲酯化率的影響。從響應面的最高點和等高線可以看出，所選擇范圍存在極值，既是響應面的最高點，也是等高線最小橢圓的中心點。

由圖5a可知，響應曲面坡度比較陡峭，反應時間和溫度對脂肪酸甲酯化率的影響比較大，這與統(tǒng)計分析結(jié)果相一致，等高線形狀反映出兩因素交互作用的強弱，可以看出反應時間和溫度兩個因素的交互作用顯著。由圖5b看出，靠近時間一側(cè)比較陡峭，靠近KOH-甲醇的一側(cè)比較平緩，說明時間的主效應大于KOH-甲醇，等高線呈橢圓形表明這兩個因素交互作用比較顯著。由圖5c看出，溫度一側(cè)明顯比KOH-甲醇一側(cè)陡峭，表明溫度的主效應大于KOH-甲醇，從等高線看出兩個因素的交互作用顯著。由圖5 d看出，催化劑用量從小到大過程中，響應曲面一直比較平坦，說明催化劑量對酯化率影響不明顯，這與統(tǒng)計分析結(jié)果相一致。由圖5 e看出，溫度一側(cè)較陡，催化劑一側(cè)較平坦，說明溫度對酯化率影響較大，而催化劑的影響效果較明顯。由圖5 f看出，響應曲面靠近KOH-甲醇一側(cè)要比催化劑一側(cè)陡峭，說明KOH-甲醇的主效應大于催化劑。

圖5 牛乳脂肪酸甲酯化影響因素兩兩交互作用的響應Fig.5 Response surface about interaction between any two factors on the conditions of fatty acid methyl ester process of bovine milk

2.3 最優(yōu)條件的確定及驗證

利用Design Expert 7.0.0軟件進一步對模型分析，得出牛乳脂肪酸甲酯化的最佳條件為：反應時間為23.05 min，反應溫度為84.24℃，KOH-甲醇的添加量為2.23 mL，三氟化硼-甲醇添加量為1.13 mL。在該酯化條件下，脂肪酸的甲酯化率可達到99.20%?？紤]實際條件的局限性，采用反應時間為23 min，反應溫度為84℃，KOH-甲醇的添加量為2 mL，三氟化硼-甲醇添加量為1 mL，進行驗證試驗，驗證試驗結(jié)果見表4。

表4 驗證牛乳脂肪酸甲酯化最優(yōu)條件的試驗結(jié)果Table 4 Verificated experiment of the optimal conditions in fatty acid methyl ester process of bovine milk(%)

由表4可知，驗證性試驗結(jié)果平均值為98.03%，與響應面模型預測值基本接近，預測值與試驗實際值相對誤差為1.19%，表明所建模型方程可靠。

優(yōu)化前后的脂肪酸氣相色譜見圖6、7。由圖6、7可知，用優(yōu)化后的方法處理樣品得到的色譜峰比未優(yōu)化方法色譜峰明顯偏多，并且峰高也比未優(yōu)化前高，表明優(yōu)化后甲酯化的效果更加明顯，更有利于脂肪酸的定性定量分析。

圖6 未優(yōu)化處理的脂肪酸氣相色譜Fig.6 Gas chromatogram of fatty acids of untreated

圖7 優(yōu)化處理后的脂肪酸氣相色譜Fig.7 Gas chromatogram of fatty acids of optimization of processing

3 討論

牛乳中脂肪酸大部分以脂質(zhì)形式存在，用氣相色譜分析，轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性好的化合物。傳統(tǒng)方法用硫酸、鹽酸等催化脂肪酸甲酯化，需加熱到較高溫度，反應時間長；堿法甲酯化反應時間短，室溫酯化，對高不飽和脂肪酸破壞小，但不能酯化游離脂肪酸；KOH-甲醇法中雖然BF3需現(xiàn)用現(xiàn)配，反應時間短且反應溫度適中，不至于破壞不飽和脂肪酸，該法優(yōu)點是脂肪酸甲酯化完全，并適用于游離脂肪酸的甲酯化。姜偉等研究葵花油中脂肪酸甲酯的制備[2]，咸漠等對菌油中脂肪酸甲酯化方法進行探討[3]，而對牛乳脂肪酸甲酯化優(yōu)化研究較少。

響應面分析試驗結(jié)果顯示因素間反應溫度和時間、溫度和KOH-甲醇量、反應時間和KOH-甲醇量的交互作用對甲酯化率的影響顯著。在較低反應溫度和較短反應時間下，脂肪酸甲酯化率較低，隨著反應時間和反應溫度的增加，脂肪酸甲酯化率逐漸升高，當達到最高點時，再增加反應時間和反應溫度脂肪酸甲酯化率開始下降；當KOH-甲醇量不變時，隨著反應溫度的增加脂肪酸甲酯化率逐漸增加隨后又開始下降，當溫度一定時，隨著KOH-甲醇量的添加脂肪酸甲酯化率逐漸增加而后基本保持不變；隨著催化劑的逐漸增加，脂肪酸甲酯化率無太大變化，而在逐漸增加溫度時添加催化劑可縮短脂肪酸甲酯化時間這與袁高峰等研究[14]相一致；KOH-甲醇量和催化劑量無明顯交互作用，相互變化對脂肪酸甲酯化率無顯著影響。采用優(yōu)化的方法對脂肪酸甲酯化處理后，利用氣相色譜測定可定性定量分析脂肪酸，且該方法既節(jié)省樣品試劑又能避免反應時間過長溫度太高使脂肪酸異構(gòu)化。

4 結(jié)論

a.在單因素試驗的基礎(chǔ)上通過響應面試驗設(shè)計，經(jīng)回歸模型與方差分析得出影響脂肪酸甲酯化因素的大小順序依次為反應溫度、反應時間、KOH-甲醇量、催化劑量。因素間交互作用分析表明溫度和時間、溫度和KOH-甲醇量、時間和KOH-甲醇量的交互作用對酯化率的影響顯著。

b.經(jīng)Design Expert 7.0軟件分析，得出脂肪酸甲酯化的最佳條件為：反應時間為23.05 min，反應溫度為84.24℃，KOH-甲醇的添加量為2.23 mL，三氟化硼-甲醇添加量為1.13 mL，在該酯化條件下，酯化率可達99.20%。進行驗證試驗，得到脂肪酸酯化率為98.03%。該方法可為氣相色譜測定牛乳脂肪酸提供最佳的前處理條件。

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Optimization of pretreatment method for fatty acids in bovine milk by gas chromatography/

LIU Ning1,2,ZHANG Zhen1,2,REN Haowei1,2,HE Yangbo1,2,CAO Yutong1,2, TAN Juzhong1,2,LI Hejia1,2(1.National Dairy Engineering&Technical Research Center,Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center,Harbin 150028,China;2.School of Food Science,Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In an effort to optimize the reaction conditions of methyl ester of fatty acid in bovine milk detected by gas chromatography,milk fatty was extracted by ammonia-ethanol method,single factor experiment and response surface analysis was used to optimize the process of fatty acid methyl.Acid values of fatty acids were determined,and the ratio of fatty acid methyl ester then was calculated.The result of response surface analysis showed that the optimum conditions of fatty acid methyl were:a reaction time of 23.05 min,temperature was 84.24℃,the additive of KOH-methyl alcohol was 2.23 mL,and boron trifluoride-methyl alcohol of 1.13 mL.Using these optimal factor values under experimental conditions, bovine milk fatty acid methyl ester of 99.20%was achieved,fatty acid methyl esterificate rate was increased distinctly after adopted to optimal conditions,samples and reagents were saved,which was significant for accurate qualitative and quantitative analysis of fatty acids.

gas chromatography;fatty acid;methyl esterification;response surface

TS252.4

A

1005-9369（2014）02-0060-08

2012-10-24

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2011BAD09B03）；東北農(nóng)業(yè)大學博士啟動基金（2010RCB75）；食品安全與營養(yǎng)協(xié)同中心項目（2012B1203D05）

劉寧（1960-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為營養(yǎng)與乳制品加工技術(shù)。E-mail:ningliuneau@gmail.com

時間2014-1-17 16:39:06[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140117.1639.010.html

劉寧,張振,任皓威,等.氣相色譜法測定牛乳脂肪酸前處理方法的優(yōu)化[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(2):60-67.

Lu Ning,Zhang Zhen,Ren Haowei,et al.Optimization of pretreatment method for fatty acids in bovine milk by gas chromatography[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(2):60-67.(in Chinese with English abstract)