李彩鳳，劉洋，越鵬，趙麗影，陳業(yè)婷，洪鑫，徐影

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

甜菜葉片中Rubisco純化及其多克隆抗體的制備

李彩鳳，劉洋，越鵬，趙麗影，陳業(yè)婷，洪鑫，徐影

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

通過(NH4)2SO4分級沉淀、凝膠層析和離子交換柱收集等步驟，優(yōu)化甜菜葉片中Rubisco的提取、純化方法，使Rubisco純化倍數(shù)達(dá)到7.7；經(jīng)Native-PAGE顯示為一條帶，純度達(dá)到90%以上，測定其全酶分子質(zhì)量為540 ku；SDS-PAGE顯示為存在兩個(gè)亞基，分子質(zhì)量分別為50和14 ku。通過免疫白兔，制備Rubisco的多克隆抗體，并經(jīng)雙向免疫擴(kuò)散法檢測，抗體效價(jià)超過1∶32。可為今后Rubisco酶學(xué)特性的進(jìn)一步研究及免疫電鏡細(xì)胞學(xué)定位奠定基礎(chǔ)。

甜菜；Rubisco；純化；多克隆抗體

Rubisco（1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶，ri?bulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase）（EC 4.1.1.39）是光合碳同化作用過程中的關(guān)鍵酶[1]，廣泛分布于具有光合功能的細(xì)胞器中[2]，由于Rubisco對葉片光合作用意義重大，占葉片中總蛋白含量比例50%，學(xué)者從水稻、煙草、小麥等多種大田作物中提取并純化得到Rubisco的活化酶（RCA），并對其分子生物學(xué)特性有一定了解[3-4]。Rubisco活化酶是一種核編碼的葉綠體蛋白，由核基因控制合成，在細(xì)胞質(zhì)中完成。該酶通常由45和41 ku兩種亞基組成，6聚體，分子質(zhì)量為250 ku[5]。但有關(guān)甜菜Rubisco的提取純化及其相關(guān)的分子質(zhì)量方面的研究鮮有報(bào)道，尤其對Rubisco多克隆抗體的制備未見報(bào)道。本研究通過（NH4）2SO4分級沉淀，結(jié)合層析技術(shù)對甜菜葉片中的光合關(guān)鍵酶Rubisco進(jìn)行提取和純化，并制備多克隆抗體，為今后Rubisco酶學(xué)特性的進(jìn)一步研究及免疫電鏡細(xì)胞學(xué)定位如膠體金標(biāo)記，以確定其細(xì)胞中的位置和含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為甜研七號二倍體純系。

1.2 Rubisco提取、純化及純度檢測方法

Rubisco的提取（4℃）：取新鮮甜菜葉片50 g，加入預(yù)冷的Tris-HCl（50 mmol·L-1，pH 7.8）提取液100 mL，內(nèi)含10 mmol·L-1EDTA；20 mmol·L-1MgCl2；0.5%Glycolic；5 mmol·L-1DTT；10 mmol·L-1抗壞血酸和1%可溶性PVP。在4℃層析冷柜內(nèi)勻漿2～3 min，勻漿液經(jīng)4層紗布過濾，并11 000 g離心10 min，收集上清液即為粗酶提取液。

Rubisco的純化（4℃）：將上述提取液，于55℃水浴恒溫保溫5 min，并用冷水浴迅速冷卻到室溫，再經(jīng)35%～55%飽和（NH4）2SO4分級沉淀，收集沉淀物，該過程在4℃層析冷柜中進(jìn)行，溶解于柱平衡緩沖液（25 mmol·L-1Tris-HCl，200 mmol·L-1NaCl；0.5 mmol·L-1EDTA）中，溶液經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析柱脫鹽，用柱平衡緩沖液平衡和洗脫，收集到的蛋白峰部分再上Q-Sepharose H.P離子交換柱，先用柱平衡緩沖液平衡，后用0～0.5 mol·L-1NaCl的柱緩沖液梯度洗脫，洗脫速度為18～20 drop·min-1，每2 mL收集一管，收集蛋白質(zhì)峰進(jìn)行純度鑒定。以上各個(gè)步驟均進(jìn)行留樣以備進(jìn)行電泳檢測純度差異。純化儀器采用?KTA prime plus蛋白層析系統(tǒng)（GE Healthcare USA），層析柱（Sephadex G-25凝膠層析柱HiTraptmDesalt?ing；Q-Sepharose H.P離子交換柱HiTrap Q H.P）均為預(yù)裝柱。

Rubisco的純度檢測：①Native-PAGE，方法參照文獻(xiàn)[6]：7.5%分離膠，4.5%濃縮膠，上樣量15 μL，在0.75 mm厚的膠板上，70 mA運(yùn)行10 min左右，轉(zhuǎn)用140 mA運(yùn)行1 h，直到溴酚藍(lán)指示帶到達(dá)底部，考馬斯亮藍(lán)R-250膠體染色后，采用常規(guī)脫色法脫色。②SDS-PAGE方法參照文獻(xiàn)[7]，有改動(dòng)：11.98%分離膠，4.38%濃縮膠，上樣量5 μL，70 mA電壓10～15 min后，140 mA電壓1 h，直到溴酚藍(lán)指示帶到達(dá)底部，采用膠體考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色方法同Native-PAGE。③紫外（UV）吸收法[8-9]于Cary50型紫外/可見分光光度計(jì)分別測定260、280 nm吸收值，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式：蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg·L-1）=1.45A280-0.74A260。

1.3 Rubisco多克隆抗體制備及效價(jià)檢測方法

試驗(yàn)以健壯新西蘭白兔作為接種對象，購于哈爾濱科隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物服務(wù)中心，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下以兔糧飼喂1周，待其情緒穩(wěn)定后，參照陳雅惠的方法進(jìn)行免疫接種[8]。

采用雙向免疫擴(kuò)散法：配制1%瓊脂糖（pH 8.6，50 mmol·L-1巴比妥）10 mL，于微波爐里加熱，趁熱（約50℃）將約4 mL融化的瓊脂糖倒在7.5 cm×2.0 cm規(guī)格的載玻片上，待瓊脂糖凝固后，打梅花型孔，孔徑3 mm，周圍孔與中間孔的距離5 mm。采用二倍稀釋法稀釋抗血清，將稀釋好的抗血清依次加入到外周孔內(nèi)，中心孔加原濃度的抗原，每孔20 μL。加樣后放入密閉濕盒中，在37℃溫箱內(nèi)保溫過夜。然后取出瓊脂糖板，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色，檢測抗體孔與抗原孔間有無沉淀線形成，并以抗血清稀釋倍數(shù)最高的一孔稀釋度作為被測抗血清的效價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Rubisco的提取、純化及純度檢測

勻漿液經(jīng)過（NH4）2SO4分部沉淀，后溶于柱平衡緩沖液后，上Sephadex G-25進(jìn)行凝膠層析脫鹽，如圖1所示。

收集蛋白峰，再上Q-Sepharose H.P，以0～500 mmol·L-1NaCl的柱緩沖液梯度洗脫，并收集蛋白峰（見圖2）。

各部均經(jīng)紫外（UV）吸收法進(jìn)行蛋白濃度測定，純化結(jié)果如表1所示。

經(jīng)過3步純化后，Rubisco比活力達(dá)到1.08 μmol CO2·min-1·mg-1protein，純化倍數(shù)達(dá)到7.7倍，回收率接近50%。

將純化過程中的酶液進(jìn)行Native-PAGE電泳，結(jié)果見圖3。

圖1 Sephadex G-25凝膠層析Fig.1 Pattern of Gel permeation chromatography with Sephadex G-25

圖2 Q-Sepharose H.P離子交換層析Fig.2 Pattern of ion exchange chromatography with Q-Sepharose H.P

表1 甜菜葉片Rubisco的純化步驟Table 1 Purification steps of sugar beet leaves Rubisco

圖3 Rubisco的Native-PAGE電泳Fig.3 Native-PAGE of Rubisco

由圖3可知，各步純化其電泳條帶逐漸變淺，說明雜蛋白的含量逐漸減少。Native-PAGE顯示最終純化的酶僅一條帶，估測其分子質(zhì)量為540 ku，且經(jīng)紫外分光光度法測定，A280/A260=1.14，即核酸含量＜2.5%，認(rèn)為其純度達(dá)90%以上；且Rubsico濃度為2.5 mg·mL-1左右，可作為抗原進(jìn)行免疫試驗(yàn)。同時(shí)將純化后的酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4，顯示甜菜葉片中的Rubisco存在兩種亞基，其分子質(zhì)量估算分別為50和14 ku。

2.2 Rubisco多克隆抗體的制備及效價(jià)檢測

將1 mL純化后Rubisco酶液（已稀釋至1 mg·mL-1）與等體積弗氏完全佐劑及0.1 mL的滅活卡介苗（75 mg·L-1），在無菌條件下將注射滴管中部快速混勻、乳化后，采用四足掌注射法（每足掌0.5 mL）對新西蘭白兔進(jìn)行免疫。1周后采用Rubisco-弗氏不完全佐劑（總量2 mL，不加卡介苗）進(jìn)行加強(qiáng)免疫；7 d后用同樣方法采用Rubisco-弗氏完全佐劑免疫；并取耳緣靜脈血1 mL作抗體檢測，發(fā)現(xiàn)抗體效價(jià)不理想，在第2天從耳緣靜脈注射0.2 mL血清抗原（不含佐劑）加強(qiáng)免疫；1周后進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，7 d后又取耳緣靜脈血1 mL，檢測抗體形成情況見圖5，抗體孔和抗原孔之間出現(xiàn)沉淀線，說明形成抗體，進(jìn)一步進(jìn)行效價(jià)檢測發(fā)現(xiàn)在1∶32孔與抗原孔間有沉淀線形成，即抗體效價(jià)達(dá)1∶32（見圖6）。

圖4 Rubisco SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of Rubisco

圖5 雙向瓊脂擴(kuò)散Fig.5 Double agar diffusion map

圖6 雙向免疫擴(kuò)散法檢測效價(jià)Fig.6 Detect the titer by double immuno diffusion

3 討論

提取純化酶時(shí)，除要考慮提取介質(zhì)的pH、離子強(qiáng)度及溫度等對蛋白質(zhì)影響較大的常規(guī)因素外，還應(yīng)該對蛋白水解酶、核酸抑制酶、穩(wěn)定蛋白象及酶活性的還原劑及金屬離子等依不同的提取目的酶的性質(zhì)予以考慮，注意提取時(shí)間對酶活影響較大的因素。

目前提取介質(zhì)都采用Tris-HCl緩沖體系，內(nèi)含蛋白水解酶抑制劑（EDTA）及抗蛋白質(zhì)疏基氧化劑，加入適量MgCl2以對離子濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)，Mg2+可對Rubisco活化；提取介質(zhì)中含有高濃度NaCl，對后期處理不利，加入β-ME，揮發(fā)性較大，對身體有害，不利于試驗(yàn)操作。李衛(wèi)芳等[3]、陳相輝[9]采用方法雖然純化效果較理想，但由于含有12.5%甘油，使操作過程中液體粘滯，不利于在機(jī)器上操作；卓敏采用的提取介質(zhì)含有0.5%Glycolic及0.01 mol·L-1抗壞血酸，此法條件較為溫和，根據(jù)幾次試驗(yàn)結(jié)果表明，其提取效果要優(yōu)于其他兩種介質(zhì)，本試驗(yàn)采用此提取介質(zhì)[10]。由于試驗(yàn)樣品量較大，參照王維光等方法[11]，加入保溫步驟（在試驗(yàn)基礎(chǔ)上調(diào)整到55℃），經(jīng)檢測，該步驟能極大的去除Rubisco粗酶液中其他蛋白質(zhì)及水解酶，雖然損失掉部分純酶，但使得后面純化步驟精度提高；通過多次驗(yàn)證，提取系統(tǒng)中加入ATP效果不明顯，本試驗(yàn)中未加入ATP；同時(shí)因試驗(yàn)材料不同（原方法其材料為水稻葉片），根據(jù)多次試驗(yàn)嘗試及綜合三種提取液效果，把pH調(diào)到7.8。

層析柱一般采用Sephadex G-25凝膠層析柱脫鹽，再上Sepharose系列陰離子交換柱，此時(shí)酶液的純度對于Rubisco非抗體類目的蛋白，已達(dá)一般試驗(yàn)要求，Makino等經(jīng)親和凝膠柱再次濃縮[12]，雖純度有所增加，由于操作時(shí)間過長，對酶活產(chǎn)生不利影響。

目前國內(nèi)關(guān)于葉片Rubisco純化基本見于水稻，小麥及煙草等作物，本試驗(yàn)對于甜菜葉片Rubisco提取及純化尚未見報(bào)道。在綜合借鑒其他試驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合甜菜材料自身特征，設(shè)計(jì)甜菜葉片Rubisco提取及純化試驗(yàn)方案，即葉片在提取介質(zhì)的保護(hù)下經(jīng)勻漿，經(jīng)35%～55%飽和硫酸銨分級沉淀，溶解后，溶液經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析柱脫鹽，再上Q-Sepharose H.P離子交換柱，最終得到較理想的純酶，本試驗(yàn)過程是在?KTA prime plus蛋白層析系統(tǒng)下進(jìn)行，重復(fù)性較好，較之以往采用的分布收集器收集更方便、快捷，且精度較高。

由于目前未見關(guān)于甜菜葉片Rubisco抗體制備研究，采用兔作為接種對象，經(jīng)過4次加強(qiáng)免疫，得到多克隆抗體。對于抗體效價(jià)檢測方法，目前主要有ELISA定量測定及免疫沉淀法，雖然ELISA定量測定靈敏度相對較高，且操作規(guī)范化，適于系列檢測，但試驗(yàn)相對復(fù)雜，對于二抗的活性要求較嚴(yán)格，對試驗(yàn)技術(shù)水平要求較高；而免疫沉淀法，特別是雙向免疫擴(kuò)散法，具有試驗(yàn)簡便靈活，干擾因素少，精度對于多克隆抗體效價(jià)的檢測已足夠達(dá)到試驗(yàn)要求；經(jīng)過瓊擴(kuò)檢測合格的抗體，一般能通過ELISA定量測定。因此，采用雙向免疫擴(kuò)散法，經(jīng)檢測效價(jià)高于1∶32，說明此方法應(yīng)用于甜菜可行。

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Rubisco purification and preparation of polyclonal antibody in sugar beet(Beta vulgarisL.)leaves

LI Caifeng,LIU Yang,YUE Peng,ZHAO Liying,CHENG Yet- ing,HONGXin,XUYing
(SchoolofAgriculture,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

The methods of Rubisco extraction and purification from sugar beet leaves were optimized through fractional precipitation of(NH4)2SO4,gelchromatography and ion exchange.The purification factor of Rubisco reached 7.7 folds;Native-PAGE shown as one band and purity above 90%,measured full enzyme molecular weight as about 540 ku;SDS-PAGE shown as two bands,which meant two subunits in existence,the molecular weight were about 50 and 14 ku.Prepared Rubisco polyclonal antibody through immunization experiment with white rabbits,then detected by double immunodiffusion experiment,antibody titers shown over 1∶32.This study laid the foundation for further research of Rubisco characteristics and the immune electron microscopy cytology positioning in the future.

sugar beet；Rubisco；purification；polyclonal antibody

S435.663；S566.3

A

1005-9369（2014）04-0036-05

2013-04-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30771276）

李彩鳳（1965-），女，教授，博士，研究方向?yàn)樽魑锷?。E-mail：caifeng-li@163.com

時(shí)間2014-4-21 13:23:33[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1323.018.html

李彩鳳,劉洋,越鵬,等.甜菜葉片中Rubisco純化及其多克隆抗體的制備[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(4)∶36-40.

Li Caifeng,Liu Yang,Yue Peng,et al.Rubisco purification and preparation of polyclonal antibody in sugar beet(Beta vulgarisL.)leaves[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶36-40.(in Chinese with English abstract)