劉營(yíng)，張明輝，甄貞，李璐，高學(xué)軍*

（1.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

OsDREB3大豆品系特異性巢式PCR及多重PCR檢測(cè)方法的建立

劉營(yíng)1,2，張明輝1,2，甄貞1,2，李璐1,2，高學(xué)軍1,2*

（1.農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物功能基因重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

為建立轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3巢式PCR檢測(cè)方法和轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR檢測(cè)方法，選擇轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2、A2704-12及OsDREB3 DNA作為多重PCR方法的待檢測(cè)基因模板，成功實(shí)現(xiàn)3種轉(zhuǎn)基因大豆、4組不同片段同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)。結(jié)果表明，可視性好，檢測(cè)下限達(dá)0.1%。轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3巢式PCR方法所用引物滿足品系特異定性檢測(cè)方法要求，其檢測(cè)靈敏度達(dá)0.005%。

轉(zhuǎn)基因大豆；OsDREB3；品系特異性；巢式PCR；多重PCR

轉(zhuǎn)基因大豆種植面積在全球持續(xù)擴(kuò)大[1-2]，抗逆轉(zhuǎn)基因大豆由于抗逆性能受到關(guān)注。改良現(xiàn)有大豆抗逆性，選育耐旱、耐鹽轉(zhuǎn)基因大豆新品種已成為轉(zhuǎn)基因大豆品種改良的重要課題[3]。本研究采用的OsDREB3是將水稻中分離得到的抗逆基因轉(zhuǎn)入大豆得到的品種，提高大豆抗逆性。

國(guó)際貿(mào)易和各國(guó)食品、生物安全等部門(mén)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品實(shí)施IP（Identity preservation）管理，加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因成分安全性檢測(cè)監(jiān)控[4]。我國(guó)有關(guān)抗除草劑及抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法已成熟并建立相應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[5-10]，而有關(guān)抗逆基因的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)尚未建立。為便于對(duì)即將商品化的轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3進(jìn)行安全監(jiān)管和檢測(cè)，本試驗(yàn)建立轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3品系特異性巢式PCR檢測(cè)方法及多重PCR檢測(cè)方法，以期建立快速、低檢測(cè)下限的OsDREB3轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

所用轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所提供；其他轉(zhuǎn)基因品種由農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心保存；非轉(zhuǎn)基因大豆購(gòu)自黑龍江唯農(nóng)種子公司。

1.2 試劑與儀器

rTaq DNA聚合酶、dNTP、DNA Marker DL 2000、Clontech Genome WalkerTMUniversal Kit試劑盒、定量PCR所需試劑均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA純化試劑盒購(gòu)自Axygen公司；引物合成和測(cè)序由北京華大基因有限公司完成。

高速離心機(jī)（購(gòu)自上海安亭，TDL-40B）、PCR儀（購(gòu)自德國(guó)Biometra，Biometra Tgradient）、核酸電泳儀（購(gòu)自杭州大和熱磁，GE-100）、紫外分光光度儀（購(gòu)自美國(guó)BECKMAN，DU?640）、凝膠成像系統(tǒng)（購(gòu)自美國(guó)UVP，G8000）、核酸蛋白分析儀（購(gòu)自DU 640，Beckman coulter）。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

稱取100 mg研磨成粉末狀樣品材料，按CTAB法提取樣品總DNA[11]。提取總DNA溶于100 μL ddH2O中，測(cè)定其濃度后，最終稀釋成100 ng·μL-1備用。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA溶液的OD260與OD280值，并計(jì)算OD260/OD280值來(lái)評(píng)價(jià)提取DNA的質(zhì)量，本研究中所用DNA的OD比值均在1.9左右。

1.3.2 品系特異性巢式PCR引物設(shè)計(jì)

采用Primer 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由北京華大基因科技有限公司合成。根據(jù)OsDREB3邊界序列[3]分別設(shè)計(jì)2對(duì)巢式定性PCR檢測(cè)引物，所擴(kuò)增片段應(yīng)覆蓋OsDREB3外源基因邊界序列及大豆基因組序列，從而品系特異性定量擴(kuò)增有效。引物設(shè)計(jì)原理見(jiàn)圖1。引物序列如表1。

圖1 巢式PCR引物設(shè)計(jì)原理Fig.1 Nested PCR primer design schematics

表1 巢式PCR所用引物Table 1 List of primers in nested PCR

1.3.3 多重PCR引物設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)基因大豆引物的設(shè)計(jì)以NCBI GenBank序列為基礎(chǔ)。依據(jù)大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因lectin基因序列（Gen?Bank序列號(hào)：K00821）；轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12（GenBank序列號(hào)：CS447634.1）；轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2（GenBank序列號(hào)：AB209952.1），多重PCR所用引物應(yīng)遵循不同產(chǎn)物大小不同，差別較大原則，同時(shí)考慮品系特異原則設(shè)計(jì)引物。利用Primer Premier V5.0軟件設(shè)計(jì)引物。序列見(jiàn)表2。

1.3.4 品系特異性巢式PCR靈敏度的確定

將轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3和非轉(zhuǎn)基因大豆按不同質(zhì)量比混合，使樣品轉(zhuǎn)基因的含量分別達(dá)到0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%，對(duì)含混合DNA樣品進(jìn)檢測(cè)方法行靈敏度測(cè)試。

1.3.5 多重PCR靈敏度的確定

將3種轉(zhuǎn)基因大豆等質(zhì)量混合后與非轉(zhuǎn)基因大豆按不同質(zhì)量比混合，使樣品轉(zhuǎn)基因的含量分別達(dá)到1%、0.8%、0.6%、0.4%、0.1%、0.05%，對(duì)含混合DNA的樣品進(jìn)行靈敏度測(cè)試。

表2 多重PCR所用引物Table 2 List of primers in triplex PCR

2 結(jié)果與分析

2.1.1 巢式PCR定性檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3巢式PCR定性檢測(cè)結(jié)果如圖2～3所示。

圖2 第1輪巢式PCR結(jié)果Fig.2 Result of the first nested-PCR

圖3 第2輪巢式PCR結(jié)果Fig.3 Result of the second nested-PCR

2輪PCR擴(kuò)增條帶清晰可見(jiàn)，說(shuō)明所設(shè)計(jì)特異的內(nèi)外引物均可作為轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3巢式PCR品系特異性檢測(cè)引物。

2.1.2 巢式PCR定性檢測(cè)結(jié)果靈敏度分析

轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3巢式PCR定性檢測(cè)靈敏度分析結(jié)果如圖4所示。

當(dāng)DNA樣品陽(yáng)性含量在0.005%及以上可擴(kuò)增出清晰條帶，當(dāng)DNA樣品陽(yáng)性含量在0.001%未見(jiàn)條帶擴(kuò)增，由此圖可確定巢式PCR定性檢測(cè)檢測(cè)下限為0.005%。

圖4 多重巢式PCR靈敏度分析Fig.4 Sensitivity analysis by the multiple PCR

2.2 多重PCR定性檢測(cè)方法的建立

2.2.1 轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR定性檢測(cè)

把握為實(shí)現(xiàn)中華民族偉大復(fù)興的中國(guó)夢(mèng)而奮斗的時(shí)代主題，是我國(guó)工人階級(jí)主力軍作用的重要體現(xiàn)，也是工會(huì)組織圍繞中心服務(wù)大局、體現(xiàn)價(jià)值彰顯作為的重要途徑。各級(jí)工會(huì)要把統(tǒng)一思想、凝聚力量作為思想政治工作的重要任務(wù)。要堅(jiān)持以社會(huì)主義核心價(jià)值觀引領(lǐng)廣大職工，培育擔(dān)當(dāng)民族復(fù)興大任的時(shí)代新人，深化“中國(guó)夢(mèng)?勞動(dòng)美”主題宣傳教育，大力弘揚(yáng)偉大民族精神和中華優(yōu)秀傳統(tǒng)文化，加強(qiáng)以職業(yè)道德為重點(diǎn)的“四德”建設(shè)，營(yíng)造健康文明、昂揚(yáng)向上的職工文化。

多重定性PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5所示，在同一PCR體系下，分別應(yīng)用各自的特異引物，轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2均擴(kuò)增出目的帶，說(shuō)明所設(shè)計(jì)引物均可作為3種轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR定性檢測(cè)引物用。

圖5 多重定性PCR分析Fig.5 Analysis by the multiple PCR

2.2.2 轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR定性檢測(cè)靈敏度分析

3種轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR定性檢測(cè)靈敏度如圖6所示，轉(zhuǎn)基因大豆樣品含量在0.1%及以上時(shí)能擴(kuò)增出較為清晰的4個(gè)目的基因，在0.05%時(shí)陽(yáng)性混合標(biāo)準(zhǔn)品中只能擴(kuò)增出lectin基因和轉(zhuǎn)基因大豆Os?DREB3特異基因，說(shuō)明多重PCR的靈敏度為0.1%。

3 討論與結(jié)論

3.1 轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3巢式PCR定性檢測(cè)方法的建立

巢式PCR（Nested PCR）是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種PCR技術(shù)，這種方法不但減少假陽(yáng)性出現(xiàn)，還使檢測(cè)靈敏度提高。利用巢式PCR檢測(cè)方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3，首先根據(jù)其品系特異性DNA片段信息設(shè)計(jì)引物。針對(duì)本試驗(yàn)5′端旁側(cè)序列信息設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)外引物，外引物擴(kuò)增片段為190 bp,內(nèi)引物目的片段均為148 bp，避免擴(kuò)增片段大導(dǎo)致假陰性結(jié)果和擴(kuò)增片段小降低反應(yīng)特異性的缺點(diǎn)。

該巢式PCR檢測(cè)體系最終靈敏度應(yīng)以第二輪PCR反應(yīng)靈敏度（0.005%）為準(zhǔn)，即巢式PCR檢測(cè)體系可檢出轉(zhuǎn)基因大豆含量達(dá)0.005%以上樣品，此檢測(cè)體系靈敏度高于Zimmermann等用巢式PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米進(jìn)行檢測(cè)所得靈敏度（0.01%）和聞偉剛等用半巢式PCR方法對(duì)轉(zhuǎn)基因大米檢測(cè)的靈敏度（0.01%）[12-13]。在理想狀態(tài)下，用巢式PCR方法可檢測(cè)到低于10-14g·μL-1DNA模板量。研究表明在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，有效模板量會(huì)低于其通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA模板量。尤其對(duì)于深加工產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，有效DNA損失會(huì)更加嚴(yán)重，用普通PCR檢測(cè)時(shí)未能完全檢出是否含有大豆成分和轉(zhuǎn)基因大豆成分，即使檢出，其重復(fù)性也不好。Martín-Sánchez等研究表明，巢式PCR方法具有高特異性和高靈敏度等特點(diǎn)[14]，其結(jié)果無(wú)需驗(yàn)證，這是巢式PCR用于檢測(cè)深加工轉(zhuǎn)基因食品優(yōu)點(diǎn)。

隨著新型轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體特異性增加，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方法將不斷改進(jìn)。而巢式PCR檢測(cè)方法靈敏度是其他檢測(cè)技術(shù)很難達(dá)到的，將是未來(lái)深加工產(chǎn)品的定性檢測(cè)技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)。

3.2 轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR定性檢測(cè)方法的建立

多重PCR技術(shù)是建立在傳統(tǒng)PCR檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上快速簡(jiǎn)便檢測(cè)手段，即在一個(gè)反應(yīng)體系中含兩對(duì)以上引物，通過(guò)PCR反應(yīng)可同時(shí)檢測(cè)多種目的核酸。目前國(guó)際上已廣泛采用PCR方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因食品檢驗(yàn)，要獲得轉(zhuǎn)基因作物的全面信息則需經(jīng)過(guò)多次PCR檢測(cè)，不但操作復(fù)雜，費(fèi)用高，且潛在污染嚴(yán)重，由此限制PCR方法在常規(guī)檢測(cè)中應(yīng)用。多重PCR方法可通過(guò)一次擴(kuò)增獲得多個(gè)目標(biāo)片段的信息，減少操作步驟和產(chǎn)物污染可能。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，尤其是對(duì)于多重PCR反應(yīng)體系都由所設(shè)計(jì)引物決定。該目的片段擴(kuò)增結(jié)果和其他檢測(cè)片段的擴(kuò)增和檢測(cè)結(jié)果都與每對(duì)引物相關(guān)，所要求的溫度條件引物間差異不能太大，引物對(duì)間不能有太多的互補(bǔ)堿基數(shù)量，否則引起引物間相互纏繞形成引物二聚體，無(wú)法進(jìn)行PCR反應(yīng)，或達(dá)不到理想反應(yīng)結(jié)果。本試驗(yàn)選擇目前已列入農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)的具有代表性的3個(gè)轉(zhuǎn)基因大豆品系，在一個(gè)體系內(nèi)檢測(cè)其共同的lectin內(nèi)源基因和3個(gè)相應(yīng)轉(zhuǎn)化體事件。所設(shè)計(jì)的多重PCR檢測(cè)用引物都是以品系特異性堿基片段為模板設(shè)計(jì)的，保證互補(bǔ)堿基數(shù)量少，且所有引物的最佳反應(yīng)溫度都是56℃，在同一溫度條件下進(jìn)行，確保多重PCR檢測(cè)精確性。在引物設(shè)計(jì)過(guò)程中，充分考慮到所擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，片段大小相差100多個(gè)堿基，范圍為700～200 bp，可視性好。本試驗(yàn)建立的多重PCR轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)體系檢測(cè)靈敏度可達(dá)0.1%，與Lu建立的多重PCR檢測(cè)體系靈敏度（1%）和Tian建立4重PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)靈敏度（0.25%和0.5%）相比較高[15-16]。整套合適的引物及配比方法，實(shí)現(xiàn)4組不同片段的同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)。

本試驗(yàn)建立的轉(zhuǎn)基因大豆多重PCR及巢式PCR檢測(cè)體系，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)識(shí)制度的實(shí)施提供可靠的檢測(cè)方法，該試驗(yàn)進(jìn)行多次重復(fù)，具有良好的可重復(fù)性。其檢測(cè)結(jié)果與普通定性PCR相比具有相同的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性，并且降低檢測(cè)成本，縮短檢測(cè)時(shí)間。

建立轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3品系特異性巢式定性PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度為0.005%；建立轉(zhuǎn)基因大豆A2704-12、轉(zhuǎn)基因大豆OsDREB3、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系特異性多重PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)靈敏度為0.1%。

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[6]農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-8-2010.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)耐除草劑大豆A5547-127及其衍生品種定性PCR方法[S].北京:中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2010.

[7]農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-7-2010.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)耐除草劑大豆A2704-12及其衍生品種定性PCR方法[S].北京:中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2010.

[8]農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-5-2012.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)耐除草劑大豆CV127及其衍生品種定性PCR方法[S].北京:中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2012.

[9]農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-1-2012.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)耐除草劑大豆356043及其衍生品種定性PCR方法[S].北京:中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2012.

[10]農(nóng)業(yè)部1782號(hào)公告-4-2012.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)高油酸大豆305423及其衍生品種定性PCR方法[S].北京:中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2012.

[11]農(nóng)業(yè)部1485號(hào)公告-4-2010.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn).轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)DNA提取和純化[S].北京:中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部,2010.

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Detecting method for event-specific nested-PCR and multiple PCR of OsDREB3 soybean

LIU Ying1,2,ZHANG Minghui1,2,ZHEN Zhen1,2,LI Lu1,2,GAO Xuejun1,2
（1.Superivision and Test Center(Harbin)for Molecular Characteristics of Genetically Modified Plants,Ministry of Agriculture,Harbin 150030,China;2.Key Laboratory of Agricultural Genomics,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

For the establishment of nested PCR detection method of transgenic soybeans OsDREB3 and multiplex PCR detection method of genetically modified soybeans,modified soybeans GTS40-3-2,transgenic soybean A2704-12 and GM soy OsDREB3 DNA were selected as gene templates of multiplex PCR method.Three kinds of genetically modified soybeans and four different fragments amplification could be detected simultaneously,and the sensitivity of multiplex PCR detection method was 0.1%.GM soybean OsDREB3 nested PCR primers were used to meet the requirements of event-specific qualitative detection methods,and the detection sensitivity was 0.005%.

transgent soybean;OsDREB3;event specific;nested PCR;multiple PCR

Q81；S565.1

A

1005-9369（2014）04-0007-05

2013-09-10

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2014ZX08004-002-002）

劉營(yíng)（1976-），女，助理研究員，博士，研究方向?yàn)檗D(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)。E-mail:lyneau@126.com。

*通訊作者：高學(xué)軍，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)與生物技術(shù)。E-mail:gaoxj5390@sina.com。

時(shí)間2014-4-21 13:24:39[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1324.026.html

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Liu Ying,Zhang Minghui,Zhen Zhen,et al.Detecting method for event-specific nested-PCR and multiple PCR of OsDREB3 soybean[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶7-11.(in Chinese with English abstract)