李文濱，劉麗雪，谷月嬌，閆海波，呂慶雪，趙琳，王朋朋，張可欣，丁福全

（東北農(nóng)業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)部大豆生物學與遺傳育種重點實驗室），哈爾濱 150030）

大豆GAMYB基因序列分析及擬南芥同源突變體鑒定

李文濱，劉麗雪，谷月嬌，閆海波，呂慶雪，趙琳，王朋朋，張可欣，丁福全

（東北農(nóng)業(yè)大學大豆生物學教育部重點實驗室，農(nóng)業(yè)部大豆生物學與遺傳育種重點實驗室），哈爾濱 150030）

GAMYB基因是赤霉素(GA)信號轉(zhuǎn)導途徑中的一個重要促進因子，該基因與植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的開花過渡以及生殖發(fā)育有重要關(guān)系。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹分析，發(fā)現(xiàn)該基因與擬南芥MYB33和MYB65親緣關(guān)系較近，根據(jù)TAIR網(wǎng)站上公布的GAMYB-Like基因信息，從美國擬南芥生物資源中心購買該基因的T-DNA插入擬南芥突變體材料，運用雙引物法對此突變體進行T-DNA插入位點的鑒定，分別獲得3株和6株穩(wěn)定遺傳的純合突變體，可為深入研究GmGAMYB基因的功能及進行互補擬南芥突變體myb33或myb65試驗奠定基礎(chǔ)。

GmGAMYB；序列分析；T-DNA插入突變體；擬南芥

大豆開花時間、花的數(shù)量及花的育性，嚴格控制大豆的生育期及產(chǎn)量，因而大豆生育期性狀的改良和花的育性一直是研究的熱點。赤霉素（GA）作為重要的植物激素[1]，在大豆整個生長發(fā)育時期具有重要作用。而GAMYB基因是赤霉素（GA）信號轉(zhuǎn)導途徑中的一個重要促進因子，該基因與植物由營養(yǎng)生長向生殖生長的開花過渡以及生殖發(fā)育有重要關(guān)系[2-5]，因此研究大豆該基因的生物學功能，對了解大豆開花及花的發(fā)育具有重要理論意義和應(yīng)用價值。

擬南芥（Arahidopsits thaliana）具有植株小、生育期短、繁殖系數(shù)高等生物學特性。對其遺傳學研究始于1907年。目前己分離得到許多擬南芥基因，利用突變體技術(shù)結(jié)合生理生化分析，是功能基因組學研究的手段之一，T-DNA插入突變技術(shù)的反向遺傳學研究策略，是研究GmGAMYB基因功能系統(tǒng)而直觀的途徑和重要手段[6]。

目前，已在大麥、水稻、燕麥、擬南芥等植物中分離得到其相應(yīng)的GAMYB基因[7-9]。GAMYB基因同源率較高，且具有高度保守結(jié)構(gòu)。擬南芥中分離出的GAMYB-Like基因，共5個。AtMYB33和AtMYB65都能代替大麥中的GAMYB基因結(jié)合到淀粉酶的啟動子上。本實驗室通過基因序列比對及進化分析發(fā)現(xiàn)GmGAMYB與AtMYB33和AtMYB65功能相似[10]。用于鑒定突變體的方法即為“雙引物法”，其基本原理，即采用特異引物擴增目的基因片段和T-DNA插入片段，通過比對擴增結(jié)果進行鑒定[11]。獲得純合突變體，可為深入研究GmGAMYB基因的功能及進行互補擬南芥突變體myb33或myb65試驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥野生型（Col-O型）和T-DNA插入突變系（Salk_009640和Salk_058312）T1代種子由美國俄亥俄州立大學ABRC（Arabidopsis Biological Resource Center）提供。GmGAMYB1由東農(nóng)42大豆品種中克隆獲得。

1.2 培養(yǎng)條件

種子經(jīng)表面消毒8 min，用無菌水清洗3～5次后點播于MS培養(yǎng)基上，置于4℃春化3 d后放入組培室中培養(yǎng)。當擬南芥種子發(fā)芽長出3～4片葉子時，將其轉(zhuǎn)到滅菌的人工土（3份蛭石，1份珍珠巖和1份黑土混合）。培養(yǎng)室溫度為（22±2）℃，光/暗周期為16 h/8 h，相對濕度80%。

1.3 單株總DNA的提取

采用SDS小量法抽提植物總DNA，取1～2 cm2的新鮮葉片液氮研磨，加入200 μL裂解緩沖液，40 μL 10%SDS，渦旋5 s后，50℃溫浴30 min其間顛倒兩次，再加入100 μL 5 mol·L-1KAc渦旋6 s，置于冰上放置30 min；加入500 μL酚/氯仿（1∶1），渦旋20 s，4℃，12 000 r·min-1離心5 min；取400 μL上清液，加入等體積的冷異丙醇，顛倒15次，4℃，12 000 r·min-1離心1 min；棄上清液，用70%乙醇洗滌后，4℃，12 000 r·min-1離心1 min；棄上清液，室溫干燥后加入50 μL無菌水溶解，5 μL RNase消化，-20℃保存[12]。

1.4 GmGAMYB1與AtMYB33和AtMYB65等基因的序列分析

使用Blast（www.phytozome.com）分析GmGAMYB1基因所編碼的氨基酸序列的相似性，并用DNA?MAN進行多重比對，構(gòu)建相關(guān)GAMYB基因系統(tǒng)進化樹。

1.5 “雙引物法”PCR鑒定

1.5.1 純合突變體的初步鑒定

首先以基因組DNA作為模板，用一對特異引物（LP和RP）擴增目的基因片段，初步鑒定出純合突變體，進行PCR擴增。PCR所用引物的設(shè)計參照SIAGnAL的相關(guān)資料（http://signal.salk.edn/is?ectprimers.html）myb33（salk_058312）的PCR引物為LP1和RP1，序列分別為：LP1 5′ATCCAGAA CTGT CAGACGCTG 3′，RP1 5′AATTGCGTATTTG GTTG GATG 3′。myb65（salk_009640）的2條PCR引物為LP2和RP2，序列分別為：LP2 5′TGGTGGG TTCC TTTTTATCAAG 3′，RP2 5′AAGCAAGACAG ACTC?CAGCAG 3′反應(yīng)體系：DNA 1 μL，10×PCR Buf?fer 2.5 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1）0.5 μL，LP1 0.5 μL，RP1 0.5 μL，Taq酶0.5 μL，ddH2O 19.5 μL，總體積25 μL，循環(huán)參數(shù)94℃5 min；38個循環(huán)：94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min；72℃5 min；取8 μL進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。

1.5.2 T-DNA插入突變的驗證

以初步鑒定為純合突變株的總DNA為模板，以LB RP1和LB RP2分別作為引物，引物序列為：LB5′ATTTTGCCGATTTCGGAAC 3′，RP15′AATTGCGTATTTGGTTGGATG 3′，RP2 5′AAGCA AGACAGACTCCAGCAG 3′進行PCR擴增。反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)及擴增結(jié)果的檢測和記錄方法同上。

1.6 表型觀察

野生型和突變體種子按照1.2所述培養(yǎng)方法在含瓊脂的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)。種子萌發(fā)后，待其長出4片葉之后，將其移入土和蛭石中培養(yǎng)，待其長大后，觀察其表型：株高，蓮座葉數(shù)，葉片大小，開花早晚等。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmGAMYB的序列分析

通過文獻確定AtMYB33和AtMYB65功能較相似并且冗余，均為GAMYB-like家族基因，將GmGAMYB1基因與下列物種的GAMYB基因進行序列比對，可知，除不同品種的大豆與基因序列極為相似外，GmGAMYB1與AtMYB33和AtMYB65是不同物種中序列最為接近的，利用突變體研究GmGAMYB1是可信的（見圖1）。

圖1 GAMYB基因系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of GAMYB gene

2.2 “雙引物法”鑒定myb33（salk_058312）

純合突變體的第一步PCR鑒定結(jié)果如圖2a所示，純合突變體的第二步PCR鑒定結(jié)果如圖2b所示。

myb33（salk_058312）突變體用LP1 RP1引物進行PCR反應(yīng)可得1 151 bp大小的目的片段，由于T-DNA的插入，所以用LB RP1引物進行PCR反應(yīng)可得592～892 bp左右的片段。

圖2 myb33第一步（a）和第二步（b）PCR鑒定Fig.2 PCR identification of the first step（a）and the second step（b）of myb33

如圖3所示，9個樣中，經(jīng)過第一步反應(yīng)知道4和5可檢測出MYB33的目的片段大小，第二步檢測T-DNA插入反應(yīng)可知2、4、6、7檢測出T-DNA插入。所以純合突變體植株即為2、6、7。

2.3 “雙引物法”鑒定myb65（salk_009640）

純合突變體的初步鑒定結(jié)果如圖3a所示，突變體純合體的鑒定結(jié)果如圖3b所示。myb65（salk_ 009640）突變體用LP2 RP2引物進行PCR反應(yīng)可得1 290 bp大小的目的片段，由于T-DNA的插入，所以用LB RP2引物進行PCR反應(yīng)可得602～902 bp左右的片段。

開花及結(jié)莢期擬南芥表型見圖4。

圖3 Myb65第一步（a）和第二步（b）PCR鑒定Fig.3 PCR identification of the first step（a）and the second step（b）of myb65

圖4 開花及結(jié)莢期擬南芥表型觀察Fig.4 Phenotype observation of flowering and fruiting period

由圖4可知，8個樣本中，經(jīng)過第一步反應(yīng)可知，5可檢測出MYB33的目的片段大小，第二步檢測T-DNA插入的反應(yīng)可知1～7檢測出T-DNA的插入。所以純合突變體植株即為1、2、3、4、6、7。

2.4 不同時期表型差異

按照1.2所述的培養(yǎng)條件，將野生型擬南芥和myb33突變體相比較，如圖5～6所示，突變植株發(fā)育相對緩慢，植株葉片較小，根系相對不發(fā)達，開花相對野生型較晚。

圖5 生長15 d擬南芥Fig.5 Arabidopsis thaliana of 15 d

圖6 生長30 d擬南芥Fig.6 Arabidopsis thaliana of 30 d

3 討論

野生型植株（Wild type,WT）目的基因的兩條染色體上均未發(fā)生T-DNA插入，以基因組DNA作為模板，用一對特異引物（LP和RP）擴增目的基因片段，PCR產(chǎn)物大小與目的基因大小一致，分子質(zhì)量約900 bp，即從LP到RP；純合突變體植株（Ho?mozygous lines,HM）目的基因的兩條染色體上均發(fā)生T-DNA插入，而T-DNA本身的長度約為17 kb，過長的模板會阻抑目的基因特異擴增產(chǎn)物的形成，所以也能得到1種以LB與RP為引物進行擴增的產(chǎn)物，分子質(zhì)量約410+N bp從LP或RP到T-DNA插入位點的片段，雜合突變體植株（Hetero?zygous lines，HZ）只在目的基因的一條染色體上發(fā)生T-DNA插入，所以PCR擴增后可同時得到410+ N bp和900 bp兩種產(chǎn)物。

對T-DNA插入突變體的鑒定，查閱相關(guān)文獻，引物的設(shè)計一般是直接利用http://signal.sulk.edu/tdnaprimers.2htm1網(wǎng)頁提供的軟件。本試驗也是根據(jù)TAIR官方網(wǎng)站公布的基因T-DNA插入位置，找到其突變體的類型，搜索到檢測所需的3條引物，對突變體進行檢測，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)條帶不專一，與固定值有些出入，但是在其給定的理論范圍內(nèi)，選取大小在范圍內(nèi)的作為T-DNA插入的突變體，用于后續(xù)試驗。

在擬南芥中有120多個擬南芥基因R2R3 MYB基因，MYB家族認為是植物最冗余的轉(zhuǎn)錄因子家族之一[13-16]。且MYB參與多種過程，包括控制細胞性狀、抗病性、調(diào)節(jié)次級代謝和激素信號轉(zhuǎn)導[17-18]。在擬南芥中最早分離出3個GAMYB-like基因，分別是AtMYB33、AtMYB65、AtMYB101,且通過前人報道可知，MYB33和MYB65在花發(fā)育階段起重要作用[19-20]。所以，GmGAMYB1可用于研究發(fā)育階段的功能。

GmGAMYB1基因的具體功能尚不明確，但是通過文獻閱讀和其他物種同源基因的功能比對可知，其除具有花藥發(fā)育等育性相關(guān)功能外，還可能含有干旱、鹽脅迫、耐高溫等生物脅迫的功能原件，是否有類似功能，有待進一步研究。

4 結(jié)論

a.通過系統(tǒng)進化樹比對，雙子葉植物大豆GAMYB基因與單子葉植物擬南芥AtMYB33和At?MYB65的親緣關(guān)系較近。其次是研究較多的葡萄屬，同時與柑橘屬、木薯屬、蓖麻和毛楊屬、李屬的GAMYB在進化上親緣關(guān)系較近。

b.試驗運用雙引物法對此突變體進行T-DNA插入位點的鑒定，分別獲得3株和6株穩(wěn)定遺傳的純合突變體，為深入研究GmGAMYB1基因功能及進行互補擬南芥突變體myb33或myb65試驗奠定基礎(chǔ)。

c.在相同培養(yǎng)條件下，發(fā)現(xiàn)AtMYB33和At-MYB65基因純合突變體與野生型Col-0的形態(tài)有差異。突變體株型變小，蓮座葉片小，開花較晚，果莢變短，成熟期晚于Col-0型。這種現(xiàn)象表明，AtMYB33和AtMYB65基因參與調(diào)控植物的生長發(fā)育。即與其同源率較高，進化相近的GmGAMYB基因也可能具有類似功能。所以本試驗獲得的AtMYB基因純合突變體，可為進一步研究大豆GAMYB基因的功能是否與擬南芥中MYB基因功能相似和互補奠定基礎(chǔ)。

[1]Schwechheimer C.Understanding gibberellic acid signaling—are we there yet[J].Curr Opin Plant Biology,2008,11:9-15.

[2]Alabad?′D,Gil J,Bla′zquez M A,et al.Gibberellins repress photo?morphogenesis in darkness[J].Plant Physiology,2004,134:1050-1057.

[3]Ballesteros M L,Bolle C,Lois L M,et al.LAF1,a MYB transcrip?tion activator for phytochrome a signaling[J].Genes Dev,2001,15:2613-2625.

[4]Ashikari M,Wu J Z,Yano M,et al.Rice gibberellin-insensitive dwarf mutant gene Dwarf 1 encodes the alpha-subunit of GTP-binding protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:10284-10289.

[5]Arabidopsis Genome Initiative.Analysis of the genome sequence of the flowering plantArabidopsis thaliana[J].Nature,2000,408: 796-815.

[6]Bouche'N,Bouchez D.Arabidopsisgene knockout:phenotypes wanted[J].Curr Opin Biotechnology,2001,4:111-117.

[7]Gubler F,Kalla R,Roberts J K,et al.Gibbemllin-regulated ex?pression of a myb gene in barley aleurone cells:Evidence for Myb transactivation of a high-pl a-amylase gene promoter[J].The Plant Cell,1995,7(11):1879-1891.

[8]Gubler F,Raventos D,Keys M,et al.Target genes and regulatory domains of the GAMYB transcriptional activator in cereal aleu?rone[J].Plant,2002,17(1):1-9.

[9]Gubler F,Watts RJ,Kalla R,et al.Cloning of a rice cDNA encod?ing a transcription factor homologous to barley GAMYB[J].Plant Cell Physiol,1997,38(3):362-365.

[10]Gocal G F W,Sheldon C C,Gubler F,et al.GAMYB-like genes,flowering,and gibberellin signaling inArabidopsis[J].Plant Physi?ology,2001,127:1682-1693.

[11]Parinov S,Sundaresan V.Functional genomics in Arabidopsis: Large-scale insertional mutagenesis cotnplements the genome se?quencing project[J].Curr Opin Biotechnology,2000(11):157-161.

[12]楊雙,阮燕燁,樊金娟,等.一種簡易的擬南芥幼苗中株微量DNA提取方法[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報,2005,36(1):99-100.

[13]Sun T P,Gubler F.Molecular mechanism of gibberellin of signal?ing in plants[J].Annual Review of Plant Biology,2004,55:197-223.

[14]Lee S,Cheng H,King K E,et al.Gibberellin regulatesArabisdopsisseed germination via RGL2,a GA I/RGA like gene whose ex?pression is up regulated following inbition[J].Genes Develop?ment,2002,16:646-658.

[15]Tyler L,Thomas S G,Hu J,et al.DELLA proteins and gibberellin regulated seed germination and floral development inArabidopsis[J].Plant Physiology,2004,135:1008-1019.

[16]Blazquez M A,Green R,Nilsson O,et al.Gibberellins promote flowering ofArabidopsisby activating the LEAFY promoter[J].Plant Cell,1998,10:791-800.

[17]Blazquez M A,Soowal L,Lee I,et al.LEAFY expression and flow?er initiation inArabidopsis[J].Development,1997,124:3835-3844.

[18]Blzquez M A,Weigel D.Integration of floral inductive signals inArabidopsis[J].Nature,2000,404:889-892.

[19]Kaneko M,Inukai Y,Uegchi Tanaka M,et al.Loss of function mu?tations of the riceGAMYBgene impair α-amylase expression in aleurone and flower development[J].The Plant Cell,2004,16(1): 33-44.

[20]Aya K,Ueguchi Tanaka M,Kondo M,et al.Gibberellin modulates anther development in rice via the transcriptional regulation of GAMYB[J].The Plant Cell,2009,21:1453-1472.

BioinformaticanalysisofsoybeanGAMYBgenesequenceand identification of its homozygous mutant inArabidopsis thaliana

LI Wenbin,LIU Lixue,GU Yuejiao,YAN Haibo,LV Qingxue,ZHAO Lin,WANG Pengpeng,ZHANG Kexin,DING Fuquan
（Laboratory of Soybean Biology in Chinese Ministry of Education＜Key Laboratory of Soybean Biology and Breeding/Genetics of Chinese Agriculture Ministry＞,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

GAMYBgene is an importantly promotive factor in the signal transduction pathways of gibberellin(GA).The gene played an important role in plant flowering transition from vegetative growth to reproductive growth and reproductive development.In order to determin wether a similar biological function existed betweenGmGAMYBgene ofGlycine maxand the one ofArabidopsisa phylogenetic tree was constructed according to GAMYB sequence data.GmGAMYBgene was closely related toArabidopsis MYB33 andMYB65.According to the information published on TAIR website,the homozygous genetic T-DNA insertion mutant of GAMYB-Like gene were obtained from TAIR.Using double primer method identified this T-DNA insertion mutant,respectively obtained three and six stably inherited homozygous mutant.These homozygous mutant lay a good foundation for further investigating the function ofGmGAMYBgene in complementingArabidopsis myb33 ormyb65 mutants.

GmGAMYB;sequence analysis;T-DNA insertion mutant;Arabidopsis thaliana

S767.5；X172

A

1005-9369（2014）04-0001-06

2012-12-12

國家自然科學基金（31101169,30671318，31271748）；黑龍江省教育廳省高校青年學術(shù)骨干項目（1253G010）；十二五農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計劃課題（2013AA102602）

李文濱（1958-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為大豆遺傳育種。E-mail：wenbinli@yahoo.com。

時間2014-4-21 13:24:10[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20140421.1324.022.html

李文濱,劉麗雪,谷月嬌,等.大豆GAMYB基因序列分析及擬南芥同源突變體鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(4)∶1-6.

Li Wenbin,Liu Lixue,Gu Yuejiao,et al.Bioinformatic analysis of soybeanGAMYBgene sequence and identification of its homozygous mutant inArabidopsis thaliana[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(4)∶1-6.(in Chinese with English abstract)