鄺婷婷， 王 宇， 王 張 ， 楊永東， 張 藝

(成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院，四川 成都611137)

蔓菁為十字花科蕓薹屬植物蕪菁Brassica rapa L. 的干燥塊根，味甘，性溫，能祛風、生赤巴、滋補、解毒，治培根病、龍病、身體虛弱、中毒?。?-2］?，F代研究發(fā)現，蔓菁提取物具有抗缺氧、提高免疫力、抗輻射等活性［3-8］。多糖是一類免疫活性物質，具有提高免疫能力的作用，廣泛存在于植物中。前期藥理實驗證明，蔓菁多糖具有緩解小鼠體力疲勞和提高耐缺氧能力的作用［9］。因此，本實驗采用柱前衍生化反相高效液相色譜法對蔓菁多糖進行單糖組成方面的研究，旨在為蔓菁多糖藥理活性方面的深入研究和保健品深度開發(fā)提供可靠依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型HPLC 色譜儀，Agilent Chemstaiton 工作站(美國Agilent 公司);HK-04B型中藥粉碎機(廣州華凱機電設備有限公司);TDZ5-WS 多管架自動平衡離心機(湘南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);Sartorius BP121s 電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司);超純水器(ULUP-1-10T 型，成都超純科技有限公司)，超聲波清洗器(CQ-250 型，上海必能信公司);Finnpipette 白色微量移液器(熱電上海公司);尼龍有機濾頭(0.45 μm，津騰公司);Labconco FreeZone冷凍干燥儀(美國LABCONCO 公司)。

1.2 材料 蔓菁藥材來源于四川省白玉縣章都鄉(xiāng)馬拉村，經成都中醫(yī)藥大學民族醫(yī)藥學院張藝研究員鑒定為十字花科蕓薹屬植物蕪菁Brassica rapa L.的干燥塊根。半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸對照品純度均在99.0%以上，購于中國藥品生物制品檢定檢驗所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)為分析純，購于成都市科龍化工試劑廠;苯酚、95%乙醇、濃硫酸為分析純，購自成都市科龍化工儀器廠;水為實驗室自制去離子水;乙腈、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 參照文獻［10-11］的方法，略有改進。Kromasil C18色譜柱 (250 mm × 4.6 mm，5 μm);乙腈為A 流動相，0.1 mol/L 磷酸鹽(KH2PO4-NaOH，pH 6.8)緩沖液為B 流動相，梯度洗脫(0 ～10 min，16%A;10 ～30 min，16% ～18%A;30 ～50 min，18% ～19% A);檢測波長250 nm;體積流量1.0 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30 ℃。

2.2 蔓菁多糖的提取 蔓菁樣品干燥粉碎(過三號篩)，取粉末約6 g，精密稱定，加80%乙醇回流提取2 次，濾渣晾干，加30 倍量水，90 ℃水浴回流提取3 次，每次2 h，合并濾液，濃縮至料液比1 ∶1，加乙醇使乙醇體積分數為80%，靜置24 h。離心棄去上層清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌至無色，再加水復溶，復溶液中加相當于其體積1/4 的sevag 試劑，劇烈振搖，離心，取上層清液再加相當于其體積1/4 的sevag試劑，重復以上操作直到無白色絮狀物產生為止;所得上層清液，加3% 的活性炭，60 ℃吸附40 min，濾過，離心，取上層清液，濃縮，真空冷凍干燥，即得蔓菁多糖。

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液 取蔓菁多糖約20 mg，精密稱定，置20 mL 具塞試管中，加2 mol/L 硫酸溶液

2.0 mL，在沸水浴中水解8 h，用8 mol/L NaOH 中和至約pH 7，用水稀釋至5 mL，離心，收集上層清液，即得。

2.3.2 對照品溶液 分別稱取半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸對照品適量，精密稱定，置10 mL量瓶中用水溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含半乳糖791 μmol/L、D-甘露糖500 μmol/L、鼠李糖305 μmol/L、阿拉伯糖1 316 μmol/L、D-無水 葡 萄 糖1 124 μmol/L、D-葡 萄 糖 醛 酸 155 μmol/L、D-半乳糖醛酸1 198 μmol/L 的對照品溶液，備用。

2.4 衍生化產物的制備 參照文獻［12-13］的方法，略有改進。將單糖對照品、混合對照品溶液及蔓菁多糖水解樣品溶液各取200 μL 分別置于10 mL離心管中，然后向其依次加0.5 mol/L PMP 甲醇溶液各200 μL 和0.3 mol/LNaOH 溶液200 μL，混勻后置于70 ℃水浴中加熱反應30 min，取出放置至室溫;再加0.3 mol/L 鹽酸溶液200 μL 中和，混勻后加1 mL 三氯甲烷渦旋混合，靜置，棄去下層液，重復3 次，上層液過0.45 μm 微孔濾膜，取10 μL 進樣，進行HPLC 分析。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系 分別精密吸取上述混合對照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系列對照品混合溶液。按“2.4”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。以對照品濃度(X)為橫坐標，色譜峰峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線，結果見表1。

表1 7 種單糖衍生產物的線性關系Tab.1 Linear relationship for precolumn derivation product of seven monosaccharide

2.5.2 精密度試驗 取對照品混合溶液，按“2.4”項下進行衍生化，依照“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次，測定半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸峰面積的RSD 分別為0.5%、0.6%、0.5%、0.4%、0.5%、0.3%和1.1%。

2.5.3 重復性試驗 取蔓菁多糖6 份，按“2.3”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進行衍生化處理，在“2.1”項色譜條件下，進行測定，記錄峰面積，計算半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸含有量的RSD 分別為1.3%、1.1%、1.7%、1.9%、1.7%、1.2%和0.8%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取蔓菁多糖，按“2.3”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進行衍生化處理，分別于衍生化反應結束后0、2、4、8、16 和24 h 進樣，記錄峰面積，結果表明樣品溶液在24 h 內穩(wěn)定，半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸峰面積的 RSD 分別為1.2%、1.3%、1.4%、1.3%、1.8%、1.7%和1.2%。

2.5.5 加樣回收率試驗 取已知含有量的蔓菁多糖約0.01 g，共6 份，精密稱定，置具塞試管中，分別精密加入不同量的半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸對照品適量，按“2.3.1”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進行衍生化處理，在“2.1”項色譜條件下，進行測定，結果見表2 ～表8。

表2 半乳糖加樣回收試驗結果Tab.2 Results of recovery tests for galactose

2.6 樣品測定 取蔓菁多糖6 份，按“2.3”項下操作制備溶液，再按“2.4”項下方法進行衍生化處理，在“2.1”項色譜條件下進行測定，記錄峰面積。根據分析和計算，求得蔓菁多糖中半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸摩爾比為1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17，色譜圖見圖1。

表3 D-甘露糖加樣回收試驗結果Tab.3 Results of recovery tests for mannose

表4 鼠李糖加樣回收試驗結果Tab.4 Results of recovery tests for rhamnose

表5 阿拉伯糖加樣回收試驗結果Tab.5 Results of recovery tests for arabincose

表6 D-無水葡萄糖加樣回收試驗結果Tab.6 Results of recovery tests for glucose

表7 D-葡萄糖醛酸加樣回收試驗結果Tab.7 Results of recovery tests for glucuronic acid

表8 D-半乳糖醛酸加樣回收試驗結果Tab.8 Results of recovery tests for galacturonic acid

圖1 對照品(A)與樣品衍生產物(B)色譜圖Fig.1 Chromatograms of standards (A)and sample precolumn derivation products (B)

3 討論

3.1 多糖水解時間的選擇 本實驗考察了蔓菁多糖完全水解所需時間及不同水解時間內單糖摩爾比的變化趨勢。結果表明，水解2、4、6、8 h 所得到的7 種單糖摩爾比呈上升趨勢，水解8 h 和10 h所得到的7 種單糖摩爾比是一致的，故選擇水解時間是8 h。

3.2 衍生化條件的影響 從對照品與樣品衍生產物色譜圖可知，衍生化后的雜質峰出現在20 min之前，可與各個單糖衍生物的峰很好地分離，不影響單糖組分的測定。由1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)的空白實驗可知，殘留的PMP 峰出在17.5 min，可與各個單糖很好地分離，其殘留不影響單糖的測定。

3.3 本實驗采用PMP 柱前衍生化HPLC 法分析蔓菁多糖中各單糖組分，結果表明蔓菁多糖由半乳糖、D-甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、D-無水葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸7 種單糖組成，其摩爾比為1 ∶0.26 ∶0.54 ∶1.06 ∶0.84 ∶0.05 ∶4.17。其中半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比含有量明顯高于葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖，其摩爾比百分比達到78.7%，說明蔓菁多糖主要由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖構成，其中半乳糖醛酸的摩爾比最大。由此可見，半乳糖醛酸在蔓菁多糖中含有量最高。

本實驗建立的PMP 柱前衍生化高效液相色譜法分析單糖的方法準確可靠，可同時檢測7 個單糖，且分離效果理想，適合于蔓菁多糖樣品的單糖組成測定，所得到的結果從側面反映了蔓菁多糖的結構。

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