蘇潔慧，李群山，劉麗芬，包永芬

(1.惠州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東 惠州 516001;2.湖北科技學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

特異性皮炎(atopic dermatitis，AD)是多發(fā)于嬰幼兒的一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚疾病，主要臨床表現(xiàn)為皮膚廣泛紅斑、丘疹、脫屑、頑固瘙癢和皮膚干燥等。流行病學(xué)研究顯示過(guò)去30 年中世界大多數(shù)工業(yè)化國(guó)家兒童AD 的患病率大幅度增加，不僅給患兒的生長(zhǎng)發(fā)育和心理健康造成極大影響，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1］。AD 的病因尚不完全清楚，有研究認(rèn)為炎性免疫機(jī)制中T 細(xì)胞因子失衡在AD 的發(fā)生和發(fā)展中起著非常重要的作用［2］。微小RNA(micro-RNA，miRNA)是一類(lèi)高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，其參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和增殖等多個(gè)生命過(guò)程［3］，包括參與了免疫細(xì)胞的分化和成熟、抗體的產(chǎn)生、炎性因子的釋放等免疫過(guò)程，對(duì)機(jī)體免疫功能的正常發(fā)揮起著非常重要的作用［4］，而miRNA 相關(guān)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)可以調(diào)控miRNA 的表達(dá)和功能［5］。目前研究較多的miRNA 前體區(qū)域基因多態(tài)SNPs 是hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913，已有多個(gè)研究顯示這些SNPs 與腫瘤、哮喘和呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)存在著關(guān)聯(lián)［6］，但其與兒童AD 易感性的相關(guān)研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬采用病例-對(duì)照研究，探討此4 個(gè)SNPs 與兒童AD 易感性的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明兒童AD 的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2004 年9 月至2012 年3 月，在惠州市某三甲醫(yī)院收集本研究所需的研究對(duì)象。病例是在該醫(yī)院兒科就診的符合Hanifin 和Rajka 診斷標(biāo)準(zhǔn)的AD 患兒，且2 周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素和3d 內(nèi)停用抗組胺類(lèi)藥物。對(duì)照組為同期在該醫(yī)院體檢合格的健康兒童400例，無(wú)蕁麻疹、濕疹和哮喘等過(guò)敏性疾病史且血液學(xué)分析、生化和免疫等檢測(cè)結(jié)果均正常，并與病例組按年齡(相差不超過(guò)1 個(gè)月)進(jìn)行1∶1 匹配，搜集符合條件的病例和對(duì)照各400例。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，并在調(diào)查員指導(dǎo)下，由研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人填寫(xiě)統(tǒng)一的調(diào)查表，調(diào)查內(nèi)容包括基本人口學(xué)信息、香煙暴露史和過(guò)敏性疾病家族史等資料。研究對(duì)象均空腹抽取外周血2～3ml，肝素抗凝，于-80℃冰箱保存。

1.2 基因型分析

共選取hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913，4 個(gè)SNPs 進(jìn)行分析。探針和引物均從ABI 公司訂購(gòu)，并按照說(shuō)明配制PCR 反應(yīng)體系，采用ABI 公司的7900HT 型高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)(兼容96 孔、384 孔和Tagman 低密度表達(dá)譜芯片)進(jìn)行PCR 反應(yīng)和終點(diǎn)讀板分析。利用SDS2.2.1 軟件分析基因分型結(jié)果。每一個(gè)384 孔板均設(shè)置3 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，采用質(zhì)量好的DNA 樣本;3 個(gè)陰性對(duì)照采用DNA 稀釋液代替基因組DNA 加入PCR 反應(yīng)體系中。每板均采用質(zhì)量控制樣本重復(fù)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果一致性為100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以χ2檢驗(yàn)和t 檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組之間的人口學(xué)特征和基因型的分布差異。對(duì)照組的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)采用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn);單因素和多因素logistic 回歸計(jì)算OR 值及其95%CI。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)概率檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS18.0 軟件包進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

兩組一般情況比較見(jiàn)表1，可見(jiàn)病例組男性比例顯著高于對(duì)照組(P ＜0.01)，病例組有過(guò)敏性疾病家庭史患者比例也顯著高于對(duì)照組(P ＜0.01)。

表1 AD 患兒和健康對(duì)照兒童的一般情況()

表1 AD 患兒和健康對(duì)照兒童的一般情況()

與對(duì)照組比較，* P ＜0.01

2.2 微小RNA 前體區(qū)域SNPs 和兒童AD 的關(guān)聯(lián)性

擬合優(yōu) 度 χ2檢驗(yàn)顯 示 hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913，4 個(gè)SNP 在對(duì)照組中的基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律(P ＞0.05)。表2 為各SNPs 基因型在病例組和對(duì)照組中的頻率分布。調(diào)整性別、年齡、家庭環(huán)境香煙暴露史和過(guò)敏性疾病家族史等變量后，多因素Logistic 回歸分析顯示:與hsa-mir-146a rs2910164 基因型為GG+CG 者相比，基因型為CC 者患AD 的危險(xiǎn)性增加(OR=1.49，95%CI:1.21-1.85，P ＜0.001);未發(fā)現(xiàn) hsa-mir-196a2 rs11614913、hsa-mir-149 rs2292832 和has-mir-499 rs374644，3 個(gè)位點(diǎn)的基因型在病例組和對(duì)照組的頻率分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)。

表2 微小RNA 前體區(qū)域基因型頻率分布以及與兒童AD 危險(xiǎn)度的關(guān)系

2.3 hsa-mir-146a rs2910164 位點(diǎn)基因頻率與兒童AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

按性別、家庭環(huán)境香煙暴露史和過(guò)敏性疾病家族史進(jìn)行分層，采用多因素Logistic 回歸分析，校正混雜因素后發(fā)現(xiàn)，攜帶CC 基因型增加AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)在男性(OR=1.60，95%CI:1.24-2.02，P＜0.001)、有家庭環(huán)境香煙暴露史(OR=2.00，95%CI:1.75-2.34，P ＜0.001)和無(wú)過(guò)敏性疾病家族史(OR=1.45，95%CI:1.11-1.85，P=0.011)的兒童中更加顯著，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 rs11614913 位點(diǎn)基因頻率與兒童AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分層分析

3 討論

miRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)21～24 個(gè)核苷酸的高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，通過(guò)降解mRNA 或者抑制蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，從轉(zhuǎn)錄后水平實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的調(diào)控，從而參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和增殖等多個(gè)生命過(guò)程［3］。近年來(lái)，有多個(gè)研究顯示miRNA 功能與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病哮喘有著密切的關(guān)系［7］。miRNA 前體區(qū)域的SNPs 可能影響其表達(dá)、成熟以及與靶mRNA 的結(jié)合，如研究表明hsa-mir-146a rs2910164 C 等位基因可顯著增加成熟 miRNA-146a 的形成［8］;hsa-mir-196a2 rs11614913 C 等位基因則會(huì)影響miRNA-196a2 的成熟過(guò)程以及與靶mRNA 的結(jié)合能力［9］。Xu Zhibin 等用NCBI dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)miRBase 中注冊(cè)的miRNAs 進(jìn)行了序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)中國(guó)人群中miRNA 前體區(qū)域高度保守，有潛在功能的SNPs僅有4 個(gè)，分別為hsa-mir-149 rs2292832、hsa-mir-146a rs2910164、has-mir-499 rs374644 和hsa-mir-196a2 rs11614913［9］，他們還報(bào)道hsa-mir-196a2 rs11614913 C 等位基因可顯著增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，且與非小細(xì)胞肺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)［10］。目前在中國(guó)人群中主要是研究此4 個(gè)miRNA 前體區(qū)域SNPs 與腫瘤的關(guān)系，其與其它疾病的關(guān)系鮮有報(bào)道。

本病例-對(duì)照研究首次探討了miRNA 前體區(qū)域4 個(gè)常見(jiàn)潛在功能位點(diǎn)與中國(guó)兒童AD 易感性的關(guān)系。結(jié)果顯示hsa-mir-146a 基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2910164 與兒童AD 易感性有關(guān);未發(fā)現(xiàn)其它3個(gè)SNPs 與AD 易感性有關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)hsamir-146a rs2910164 C 等位基因可顯著增加成熟miRNA-146 水平，另外功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明成熟的miRNA-146 通過(guò)TNF-α 途徑影響IL-8 和CCL5/RANTES 等炎性因子的釋放參與機(jī)體炎性免疫反應(yīng)［11］，提示rs2910164 CC 基因可能通過(guò)影響成熟miRNA-146 水平，從而調(diào)節(jié)機(jī)體炎性免疫反應(yīng)而使兒童AD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加。分層分析顯示，rs2910164 CC 基因型增加兒童AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在男性、有家庭環(huán)境香煙暴露史和無(wú)過(guò)敏性疾病家族史的兒童中更加顯著。有家庭環(huán)境香煙暴露史的兒童rs2910164 CC 基因型增加AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)更加顯著，提示rs2910164 CC 基因型與香煙暴露在促進(jìn)兒童皮膚炎性免疫反應(yīng)中存在協(xié)同作用。在有過(guò)敏性疾病家族史的患兒中rs2910164 CC 基因型效應(yīng)不明顯，可能是由于過(guò)敏性疾病家族史是兒童AD 較強(qiáng)的危險(xiǎn)因素，掩蓋了rs2910164 CC基因型的效應(yīng)。

綜上，miRNA 前體區(qū)域hsa-mir-146a 基因多態(tài)性位點(diǎn)rs2910164 CC 基因型可顯著增加兒童AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但該結(jié)果還需在其他地區(qū)人群中擴(kuò)大樣本量進(jìn)行重復(fù)、驗(yàn)證，rs2910164 CC 基因型增加兒童AD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚有待進(jìn)一步功能學(xué)探索。

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