陳夢(mèng)瑩，陳祥福，崔萌，魏娟娟，潘陽(yáng)露，潘宇，李金華，張興國(guó)

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715）

ipt基因在植物基因工程中的應(yīng)用

陳夢(mèng)瑩，陳祥福，崔萌，魏娟娟，潘陽(yáng)露，潘宇，李金華，張興國(guó)

（西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶市蔬菜學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715）

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶IPT是細(xì)胞分裂素生物合成過(guò)程中的限速酶，其編碼基因ipt已被克隆并得到廣泛應(yīng)用。簡(jiǎn)要介紹了在植物遺傳轉(zhuǎn)化中控制ipt表達(dá)的啟動(dòng)子，綜述了ipt在植物基因工程中的應(yīng)用，并分析了目前ipt基因在植物基因工程應(yīng)用中存在的一些問(wèn)題。

異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因（ipt)；植物基因工程

細(xì)胞分裂素（Cytokinin，CTK）是促進(jìn)細(xì)胞分裂的激素，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中行使重要功能，如參與細(xì)胞分裂、光合作用、衰老及營(yíng)養(yǎng)代謝等過(guò)程。1963年，Letham從未成熟的甜玉米中發(fā)現(xiàn)并純化得到細(xì)胞分裂素，俗稱(chēng)玉米素（Zeatin），這與先前報(bào)道Miller從玉米中分離但未完全純化的細(xì)胞分裂物質(zhì)相同[1]。細(xì)胞分裂素從化學(xué)角度看主要分為兩類(lèi)，一類(lèi)是在天然細(xì)胞分裂素異戊烯腺嘌呤N6位上進(jìn)行取代，側(cè)鏈通常為芳香環(huán)衍生物或類(lèi)異戊二烯基，包括6-呋喃甲基腺嘌呤（KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）等，稱(chēng)嘌呤型細(xì)胞分裂素；另一類(lèi)為苯基脲型細(xì)胞分裂素，即N，N'-二苯基脲（DPU）以及一些苯基脲的衍生物，如噻重氮苯基脲、N-（4-吡啶基）N'-苯基脲、N-苯基-N'-（2-氯-4-吡啶基）脲等。目前，在細(xì)胞分裂素生物合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用的一些酶的特性已得到研究，有些還被克隆出了對(duì)應(yīng)的基因[2]。其中，異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（Isopentenyl-transferase，IPT）是植物細(xì)胞分裂素生物合成中的限速酶。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因最初在根癌農(nóng)桿菌中得到鑒定，命名為tmr，后稱(chēng)為ipt，IPT酶的活性也逐步在多種植物的粗提取物中被檢測(cè)到[3，4]。隨著擬南芥基因組測(cè)序工作的完成，編碼IPT的基因家族也被證實(shí)，包括9個(gè)成員證明除以外，其他7個(gè)基因能夠編碼大腸桿菌中細(xì)胞分裂素的生物合成[5]。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因（ipt）的廣泛應(yīng)用，對(duì)深入了解細(xì)胞分裂素的生理作用及通過(guò)植物基因工程技術(shù)控制植物生長(zhǎng)發(fā)育方面具有重要意義，也使植物激素的基因工程在遺傳育種中的應(yīng)用方面展現(xiàn)了新的作用。

1 基因工程中ipt基因表達(dá)的調(diào)控

早期研究發(fā)現(xiàn)，使用IPT和花椰菜花葉病毒（CaMV）35S這兩種啟動(dòng)子控制ipt基因在轉(zhuǎn)化植株中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其控制下的ipt基因均組成型過(guò)量表達(dá)，產(chǎn)生的細(xì)胞分裂素濃度較高，從而導(dǎo)致一系列反常的發(fā)育，如抑制莖伸長(zhǎng)、喪失頂端優(yōu)勢(shì)、抑制側(cè)根形成、表現(xiàn)矮化及形成小圓葉[6～8]。為解決該問(wèn)題，各類(lèi)非組成型表達(dá)啟動(dòng)子被用來(lái)控制ipt基因的表達(dá)（表1），使其表達(dá)水平、表達(dá)的空間和時(shí)間受到限制。

表1 ipt在植物基因工程中使用的啟動(dòng)子

2 提高轉(zhuǎn)化效率

細(xì)胞分裂素能促進(jìn)植物組織的分化和生長(zhǎng)，是誘導(dǎo)植物不定芽分化的關(guān)鍵激素。當(dāng)煙草等植物表達(dá)外源ipt基因時(shí)，不定芽再生得到了促進(jìn)[10]。ipt基因促進(jìn)了矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化中不定芽的誘導(dǎo)，不定芽誘導(dǎo)率顯著高于對(duì)照[8]。這種效應(yīng)已用來(lái)解決難以再生植物的離體分化問(wèn)題。當(dāng) 基因轉(zhuǎn)入杜仲后，其不定芽誘導(dǎo)率為2.95%，比未轉(zhuǎn)ipt基因的對(duì)照有明顯增加，說(shuō)明ipt作為外源基因轉(zhuǎn)入不定芽誘導(dǎo)困難的植物杜仲，提高了其遺傳轉(zhuǎn)化效率[12]。

3 作為選擇標(biāo)記基因

ipt基因表達(dá)能促進(jìn)不定芽分化并導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物表型反常變化，具有誘導(dǎo)表型效應(yīng)。因此，ipt可作為簡(jiǎn)單表型標(biāo)記來(lái)篩選轉(zhuǎn)化子，直觀地指示是否得到轉(zhuǎn)基因植株[22]。使用ipt基因作為選擇標(biāo)記，使轉(zhuǎn)基因組織能在沒(méi)有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基上完成分化[29]。將35S-ipt基因與卡那霉素同時(shí)使用時(shí)，轉(zhuǎn)化效率比單獨(dú)使用卡那霉素提高1.6倍，說(shuō)明抗生素與ipt結(jié)合使用效果會(huì)更好[30]。

使用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，無(wú)ipt等選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)已建立。擬南芥熱激啟動(dòng)子hspl8.2可驅(qū)動(dòng)flp重組酶基因，從而熱誘導(dǎo)刪除外源基因，當(dāng)與ipt基因串聯(lián)后，獲得轉(zhuǎn)基因植株后進(jìn)行熱激處理，刪除ipt標(biāo)記基因，使植物的生長(zhǎng)發(fā)育恢復(fù)正常[8]。Cre重組酶系統(tǒng)可以從轉(zhuǎn)基因柑橘中高效刪除ipt標(biāo)記基因，達(dá)到非常高的刪除效率[11]。利用重組酶系統(tǒng)刪除轉(zhuǎn)基因植物中的篩選標(biāo)記基因等外源基因，可消除人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的安全顧慮，是目前轉(zhuǎn)基因安全控制的研究方向之一。

4 延緩衰老

在20世紀(jì)30年代末就有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素可以延緩葉片衰老。有研究表明，細(xì)胞分裂素是一種有效的抗衰老調(diào)節(jié)劑，其作用機(jī)理主要涉及以下幾個(gè)方面：a.提高細(xì)胞外轉(zhuǎn)化酶的活性；b.促進(jìn)活性氧的清除，以減緩脂質(zhì)氧化程度而延緩衰老；c.降低對(duì)乙烯和ABA的敏感性[31]。

有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)基因工程手段將ipt基因?qū)胫参镏?，可以控制植株的生長(zhǎng)和衰老。Smigocki等[32]用融合基因轉(zhuǎn)化煙草，延遲了整個(gè)植株的衰老。張賽群等[13]通過(guò)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，構(gòu)建嵌合基因，并對(duì)5個(gè)番茄品種進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，最后獲得來(lái)自31個(gè)不同外植體的44棵轉(zhuǎn)化再生植株，對(duì)其中一部分單株進(jìn)行PCR檢測(cè)證明為轉(zhuǎn)基因植株，觀察其田間生長(zhǎng)狀況，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)旺盛并表現(xiàn)出抗葉片衰老的特性。張治禮等[15]將嵌合基因?qū)霗烟曳眩瑢?duì)其中14株轉(zhuǎn)化植株與對(duì)照中的2株進(jìn)行葉片葉綠素、細(xì)胞分裂素檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照相比，不同葉位的葉片葉綠素、細(xì)胞分裂素含量顯著提高，而同一葉位的葉片則與對(duì)照相比延緩15～20 d衰老。Lai等[33]研究了聚乙二醇滲透脅迫對(duì)轉(zhuǎn)大丁草葉片中抗氧化酶活性的影響，抗氧化酶活性被激活后，在轉(zhuǎn)基因植株中的活性比未轉(zhuǎn)基因?qū)φ仗岣吆芏?，說(shuō)明滲透脅迫誘導(dǎo)的延緩葉片衰老是抗氧化酶活性增高引起的。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將嵌合基因?qū)朊藁ㄖ校?jīng)過(guò)卡那霉素抗性篩選和檢測(cè)共獲得9個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，后期測(cè)定結(jié)果表明，葉片細(xì)胞分裂素、葉綠素及可溶性蛋白等的含量明顯高于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因棉花葉片衰老得到延緩[34]。Huo等[25]使用大豆GmSARK啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控ipt基因表達(dá)，qRT-PCR的結(jié)果表明ipt基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)受衰老的特異性控制，并延緩了葉片衰老。

5 參與防御反應(yīng)

與其他植物激素類(lèi)似，細(xì)胞分裂素在植物遭受逆境脅迫時(shí)能夠及時(shí)響應(yīng)并調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。此外，細(xì)胞分裂素還可以與其他內(nèi)源激素共同參與反應(yīng)，通過(guò)使植物體內(nèi)的生理產(chǎn)生變化來(lái)避免植物受病蟲(chóng)害干擾等。在與一些逆境脅迫相關(guān)的蛋白方面，細(xì)胞分裂素對(duì)其誘導(dǎo)和調(diào)控也起著重要作用。

ipt基因在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)，使葉綠素含量增加、光合作用增強(qiáng)，使根系保持較高的活力，增強(qiáng)根對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和礦質(zhì)元素的吸收和利用，也抵御了低溫的為害[35]。逆境啟動(dòng)子rd29A在4℃低溫誘導(dǎo)12 h時(shí)，能夠很好地調(diào)控ipt基因的表達(dá)，使煙草外植體在遭受逆境脅迫時(shí)也能正常分化，達(dá)到較高的抗性愈傷誘導(dǎo)率[24]。劉麗君等[36]在轉(zhuǎn)基因的大豆中，通過(guò)內(nèi)源IAA、ABA含量的增加，SOD酶活性增強(qiáng)，MDA（丙二醛）含量減少，來(lái)改變大豆的形態(tài)以提高抗病性。玉山江等[37]對(duì) ipt轉(zhuǎn)基因秈稻植株進(jìn)行干旱脅迫，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞分裂素含量和葉綠素含量顯著高于野生型，很大程度上延緩了莖葉衰老，葉片溫度顯著低于野生型。孫雷心[38]通過(guò)馬鈴薯創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控改良過(guò)的細(xì)胞分裂素基因在植物中表達(dá)，可使植物在僅遭受食害或創(chuàng)傷時(shí)產(chǎn)生該種激素并促進(jìn)了傷口愈合，與導(dǎo)入抗蟲(chóng)基因相比更接近于植物的天然防御能力。

6 指導(dǎo)有機(jī)物質(zhì)的積累與分配

細(xì)胞分裂素可以指導(dǎo)植物中有機(jī)質(zhì)的分布，這為改良作物品質(zhì)及提高蛋白含量提供了一種可能的途徑。毛自朝等[17]將果實(shí)特異性啟動(dòng)子2A12控制的ipt基因在番茄中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)果實(shí)中細(xì)胞分裂素含量增高從而使果實(shí)中胎座組織增厚和種子發(fā)育停滯，最后得到無(wú)籽番茄果實(shí)；由于ipt基因的表達(dá)使果實(shí)成熟過(guò)程受阻，也使得果實(shí)采后儲(chǔ)藏時(shí)間延長(zhǎng)了10 d左右，隨后研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因番茄的坐果率和產(chǎn)量都有不同程度的提高，可溶性糖含量略低，但果實(shí)中粗蛋白和干物質(zhì)含量都有明顯增高。王亞琴等[39]將葉片衰老抑制基因經(jīng)基因槍導(dǎo)入秈稻，轉(zhuǎn)基因植株的有效穗數(shù)和千粒質(zhì)量比對(duì)照顯著增加，說(shuō)明其在延緩葉片衰老的同時(shí)能提高葉片利用光能的時(shí)間，從而積累大量的光合產(chǎn)物。小麥高分子量麥谷蛋白亞基12啟動(dòng)子與ipt基因嵌合后轉(zhuǎn)化煙草，使細(xì)胞分裂素含量有所增加，且少量細(xì)胞分裂素的異常表達(dá)在一定程度上使貯藏同化累積增加[40]。

7 誘導(dǎo)單性結(jié)實(shí)

單性結(jié)實(shí)是指在天然或人工作用下使胚珠不經(jīng)授粉而子房發(fā)育形成果實(shí)的現(xiàn)象。在胚珠未經(jīng)受精的情況下，可形成無(wú)籽果實(shí)。生長(zhǎng)素、脫落酸和赤霉素等植物激素對(duì)單性結(jié)實(shí)有顯著的影響，且各激素的平衡比單一激素對(duì)單性結(jié)實(shí)的影響效應(yīng)要大。環(huán)境因子如溫度、光照等也會(huì)通過(guò)影響植物激素的合成從而間接影響單性結(jié)實(shí)。利用果實(shí)特異性啟動(dòng)子在番茄中大量表達(dá)ipt基因能得到穩(wěn)定的單性結(jié)實(shí)株系[41]。

8 產(chǎn)生雄性不育后代

利用植物雄性不育為基礎(chǔ)的雜種優(yōu)勢(shì)已成為許多作物育種的重要目標(biāo)和方向。到目前為止，利用轉(zhuǎn)基因的方法獲得植物雄性不育材料已有很多研究。在花藥發(fā)育到花粉粒成熟過(guò)程中有一系列基因的表達(dá)，這些基因的異常表達(dá)往往導(dǎo)致部分或全部的花粉敗育。利用花藥絨氈層特異性啟動(dòng)子TA29調(diào)控ipt基因的表達(dá)，可使轉(zhuǎn)基因植株雄蕊中細(xì)胞分裂素的含量比對(duì)照高出3～4倍，讓原本花藥發(fā)育過(guò)程中平衡的激素環(huán)境發(fā)生紊亂，進(jìn)而使花藥和花粉的正常發(fā)育受阻，最后獲得雄性敗育株系[16]。

9 問(wèn)題與展望

綜上所述，到目前關(guān)于ipt基因在植物轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用的實(shí)例已有很多，但仍存在一些問(wèn)題：

①特異性啟動(dòng)子控制ipt基因的表達(dá)在煙草、番茄等雙子葉植物上的應(yīng)用較多，而在單子葉植物和多年生植物中的應(yīng)用相對(duì)較少。不同啟動(dòng)子間的研究也存在差異，如衰老組織特異表達(dá)啟動(dòng)子SAG12的研究應(yīng)用相對(duì)較多，但其他特異性啟動(dòng)子的研究則較少。

②對(duì)轉(zhuǎn)ipt基因植株中細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的相互作用機(jī)制及激素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響等方面仍需進(jìn)一步探索。

③大部分轉(zhuǎn)ipt基因的研究仍處于植株轉(zhuǎn)化階段，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的生理方面沒(méi)有進(jìn)行深入研究。在 延遲衰老方面，除了發(fā)現(xiàn)延緩下部葉片脫落和細(xì)胞分裂素含量增加外，一些轉(zhuǎn)化植株還存在著許多與野生型不同的特征。因此，在這方面還有待改善并加強(qiáng)分子水平的解釋。

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Application of ipt Gene in Plant Genetic Engineering

CHEN Mengying,CHEN Xiangfu,CUI Meng,WEI Juanjuan,PAN Yanglu, PAN Yu,LI Jinhua,ZHANG Xingguo

Isopentenyl-transferases(IPT)catalyze the first and rate-limiting step of cytokinin biosynthesis,and its coding genes have been cloned and used widely.This paper introduced the promoters controlling the expression of ipt gene in plant genetic transformation briefly,and reviewed the application of ipt in plant gene engineering,at the same time,the paper analyzed the related existing problems.

Isopentenyl-transferase gene(ipt);Plant genetic engineering

Q943.2

A

1001-3547（2014）16-0009-05

10.3865/j.issn.1001-3547.2014.16.002

科技部“863”項(xiàng)目資助（2010AA10060705)

陳夢(mèng)瑩（1990-)，女，碩士，研究方向?yàn)槭卟朔肿由飳W(xué)與基因工程，電話：18883734633，E-mail：meng.ying.2009@163.com

張興國(guó)，通信作者，研究員，從事蔬菜分子生物學(xué)與遺傳育種研究，E-mail：zhangxg63@163.com

2014-06-23