成曉霞，張志琪，湯 薇，王亞芹，袁文娟，肖婭萍，3*

1藥用植物資源與天然藥物化學教育部重點實驗室;2 陜西師范大學化學化工學院，西安 710062;3陜西國際商貿學院醫(yī)藥學院，西安 712046

大金發(fā)蘚Polytrichum commune L.ex Hedw.為金發(fā)蘚科Polytrichaceae、金發(fā)蘚屬Polytrichum 植物，又名獨根草、土馬鬃、巖上小草等，生于林下濕地，常形成大片群落覆蓋地面，廣泛分布于我國南北各地［1，2］。大金發(fā)蘚作為藥用苔蘚最早出現在宋代的《嘉祐補注本草》中，《本草綱目》及《中華本草》對其藥性描述為全草入藥，味甘，性涼。能滋陰清熱，涼血止汗，氣味甘浚，無毒。對高夫克氏球菌、金色葡萄菌、肺炎球菌、結核桿菌有抗性，并對淋巴細胞白血病等癌癥有一定抑制作用［3，4］。近年來陸續(xù)有報道稱從檜葉金發(fā)蘚Polytrichum juniperum，多形金發(fā)蘚Polytrichum ohioense Ren＆Card 和變形金發(fā)蘚Polytrichum pallidisetum Funck 中分離得到一系列新化合物并初步驗證其具有抗癌活性［5-7］。因此，本文對大金發(fā)蘚的化學成分和抗腫瘤作用進行初步探究，以期為金發(fā)蘚屬植物藥用價值的開發(fā)應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 植物樣品

大金發(fā)蘚地上全草于2009年8 月采自陜西秦嶺南麓平河梁(海拔2305 m，33°27' N，108°30' E)，經陜西師范大學肖婭萍教授鑒定為金發(fā)蘚屬大金發(fā)蘚Polytrichum commune L.ex Hedw。

1.2 供試腫瘤細胞

L1210 小鼠淋巴白血病細胞，人乳腺癌MDAMB-231、MCF-7 細胞，人食管癌Eca-109 細胞，人結直腸癌SW-480、SW-620 細胞，人胚腎細胞HEK-293，均由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心引進，本室傳代保種。K562 人慢性髓系白血病細胞和U937 人急性單核白血病細胞由中國北京協和醫(yī)科大學引進，本室傳代保種。以上腫瘤細胞均按照美國模式菌種收集中心(ATCC)提供方法進行培養(yǎng)。

1.3 主要試劑

DMEM、PRMI1640、L-15 和馬血清均購自Gibco公司，胎牛血清(Hyclone 公司)，谷氨酰胺(Amresco公司)，超純水(Millipore 公司)，二甲基亞砜(DMSO)和噻唑藍(MTT)均購自Sigma 公司，化學成分預試所用試劑均為國產分析純，自配。

1.4 主要儀器

萬分之一電子天平(塞多利斯科學儀器北京有限公司)，KQ-300DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，RE-52AA 旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)，HH-6B 數顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，生物材料粉碎機，超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司)，倒置顯微鏡(IMT-2，Olympus 公司)，臺式高速離心機(Eppendorf 公司)，高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)，酶標儀(型號BIO-TEK-ELX800，Tecan 公司)，96 孔培養(yǎng)板(Costar 公司)。

1.5 大金發(fā)蘚化學成分預試驗

按照植物化學成分系統(tǒng)預試的常規(guī)方法［8］進行大金發(fā)蘚石油醚提取液、水提取液及乙醇提取液的制備，通過傳統(tǒng)試管預試方法結合紙色譜法進行揮發(fā)油、油脂、蛋白質、氨基酸、糖類、皂苷、生物堿、黃酮、蒽醌、香豆素、木質素等化學成分的檢測。

1.6 大金發(fā)蘚提取物制備

收集大金發(fā)蘚全株，制備成粉末，用乙醇結合超聲提取，30 min/次，共計3 次，收集合并提取液，減壓濃縮后通過真空冷凍干燥得大金發(fā)蘚乙醇提取物(Ethanol extract from Polytrichum commune L.ex Hedw，EPCLH)。將EPCLH 溶解于70% 乙醇，室溫條件下3 000 rpm 離心15 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后進行抗癌活性檢測［9］。

1.7 大金發(fā)蘚腫瘤細胞毒活性檢測

細胞存活率采用MTT 法進行檢測［9］。收集對數生長期細胞，以1 ×105個/mL 接種于96 孔板中培養(yǎng)。實驗分為空白對照組、陰性對照組(70%乙醇)、陽性對照組(0.5 μg/mL 紫杉醇)和給藥組(EPCLH)，細胞加藥后連續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入5 g/L 的無菌MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去各孔培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，200 rpm搖床震蕩10 min，待完全溶解后用酶標儀測定570 nm 吸光度(A)，校正波長為630 nm。每組設6 個復孔，實驗重復3 次。細胞存活率=A加藥組/ A對照組×100%。結合藥物的作用劑量，推算出藥物對腫瘤細胞的半數抑制濃度IC50，以此衡量藥物的抗癌活性。

1.8 數據分析

實驗數據均以Mean±SD 進行表示。采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計分析。藥物濃度與細胞生長抑制率的關系用線性回歸與相關分析，組間比較使用T-test。

2 結果與分析

2.1 大金發(fā)蘚化學成分預試驗結果

大金發(fā)蘚石油醚提取液、水提取液及乙醇提取液的化學成分預試結果(表1)表明，大金發(fā)蘚中含有揮發(fā)油或油脂、糖類、皂苷、生物堿、黃酮、香豆素及其萜類內酯化合物，無法確定是否存在蛋白質、氨基酸、蒽醌及木質素類化合物。

表1 大金發(fā)蘚化學成分系統(tǒng)預試驗結果Table 1 Systematic pre-test results on chemical composition of P.commune

2.2 大金發(fā)蘚提取物制備結果

大金發(fā)蘚300 g 經乙醇提取后得浸膏16.7 g，計算得率為5.57%。大金發(fā)蘚孢子體(J-BZ)100 g經乙醇提取后得浸膏8.73 g，計算得率為8.73%。大金發(fā)蘚配子體(J-PZ)300 g 經乙醇提取后得浸膏9.33 g，計算得率為3.11%。結果提示大金發(fā)蘚孢子體中化學物質種類和含量均有可能高于其配子體。

2.3 大金發(fā)蘚抗腫瘤活性分析

2.3.1 大金發(fā)蘚乙醇提取物抑制腫瘤細胞增殖及對正常細胞生長的影響

將大金發(fā)蘚乙醇提取物(EPCLH)分別與表2所列的腫瘤細胞在實驗條件下共孵育，結果顯示，作用24 h 后，120 μg/mL 的EPCLH 能將L1210 細胞的存活率降至30%以下。相同劑量作用下，MDAMB-231 和MCF-7 細胞的增殖能力也受到一定抑制，但作用48 h 后仍未能使細胞存活率降至50%以下。EPCLH 對食管癌細胞和結直腸癌細胞生長的影響明顯低于其對白血病細胞的毒性作用。以上結果提示，L1210 白血病細胞對EPCLH 的毒性作用較為敏感。

表2 大金發(fā)蘚乙醇提取物抑制腫瘤細胞增殖活性(n=6，)Table 2 Anti-tumor activity of P.commune ethanol extract (n=6，)

表2 大金發(fā)蘚乙醇提取物抑制腫瘤細胞增殖活性(n=6，)Table 2 Anti-tumor activity of P.commune ethanol extract (n=6，)

為進一步驗證EPCLH 的細胞毒活性，本實驗比較了其對L1210 細胞和HEK 293 細胞生長的影響，同時以紫杉醇(0.5 μg/mL)作為陽性對照。結果如圖1 所示，EPCLH 可明顯抑制L1210 細胞的增殖，且具有劑量依賴效應。當藥物作用24 h 后，隨著藥物劑量由30 μg/mL 增加到120 μg/mL，細胞存活率則由82.91%下降至26.99%，此時的半數抑制濃度(IC50)為77.22 μg/mL。與對照組相比，30 μg/mL的EPCLH 即可對L1210 細胞的生長產生抑制作用(P＜0.05)，當藥物劑量由60 μg/mL 增加至120 μg/mL 時，抑制作用愈發(fā)明顯(P＜0.01)。而相同實驗條件下，紫杉醇對細胞的抑制率僅為20%，與90 μg/mL 的EPCLH 相比差異極顯著(P＜0.01)。此外，EPCLH 對L1210 細胞和HEK-293 細胞的生長影響差異極顯著(P＜0.01)，相同劑量的EPCLH 能夠顯著降低L1210 白血病細胞存活率的同時對HEK-293 人胚腎細胞的生長不產生明顯影響。

圖1 大金發(fā)蘚乙醇提取物對L1210 細胞和HEK-293 細胞的增殖抑制作用Fig.1 Cytotoxicity effect of EPCLH on L1210 cells and HEK-293 cells

2.3.2 大金發(fā)蘚孢子體與配子體對白血病細胞毒性的比較

植物在不同生長時期所含化學物質的種類及含量也略有變化，以體外培養(yǎng)的白血病細胞為實驗模型，對大金發(fā)蘚的孢子體(J-BZ)與配子體(J-PZ)的乙醇提取物進行抗腫瘤活性檢測。將相同劑量的J-BZ與J-PZ 分別加入L1210 細胞、K562 細胞及U937 細胞，共孵育24、48、72 h，比較分析三種白血病細胞在兩種提取物的干預下相對存活率的變化，結果見圖2。

J-BZ 能夠在作用24 h 即對K562 細胞的生長造成影響，當作用劑量為80 μg/mL 時，細胞生長被抑制，細胞存活率降至50%左右，當藥物濃度增至120 μg/mL，細胞存活率低于20%(Fig.2A)。相同條件下，當J-PZ 的濃度為160 μg/mL 才能使細胞存活率降至20%以下(Fig.2B)。整體看來，J-BZ 與J-PZ均能對K562 細胞的增殖起到抑制作用，但處理相同時間后(24 h)，二者表現出的抗腫瘤能力大小卻明顯不同，低劑量時差異極顯著(P＜0.01)，當細胞存活率降至20%以下，二者差異顯著(P＜0.05)(Fig.2C)。

當等劑量的J-BZ 與J-PZ 作用于L1210 細胞時，結果如圖2D～F 所示，二者對細胞生長的影響在48 h 表現最明顯。當藥物濃度為80 μg/mL 時，J-BZ 與J-PZ 作用下的細胞存活率分別為47% 和70%;藥物濃度增至120 μg/mL，J-BZ 可使細胞存活率降至20%以下，而J-PZ 處理后的細胞存活率為40%;160 μg/mL 的J-BZ 已使得細胞幾乎不再生長，同劑量的J-PZ 此時將細胞存活率保持在20%左右。當J-BZ 與J-PZ 的作用劑量大于200 μg/mL后，細胞幾無存活。因此，就200 μg/mL 以下的三種藥物濃度對L1210 小鼠白血病細胞的存活影響力而言，大金發(fā)蘚孢子體明顯優(yōu)于其配子體(P＜0.01)。

圖2 大金發(fā)蘚孢子體與配子體對白血病細胞增殖的影響Fig.2 Cytotoxicity effect of sporophyte and gametophyte on leukemia cells

在U937 細胞的生長過程中加入等濃度的J-BZ與J-PZ，二者均表現出明顯的時間、劑量依賴性。當J-BZ 與細胞共孵育72 h，隨著藥物濃度由80 μg/mL 增至120、160 μg/mL 后，細胞存活率依次降為65%、30%、15%(Fig.2G)。相同的作用時間內，80 μg/mL 的J-PZ 幾乎未對細胞的生長造成影響，當藥物劑量為160 μg/mL，細胞存活率保持在60%左右，直至藥物濃度達到240 μg/mL，細胞存活率才下降至20%(Fig.2H)。比較分析二者對細胞增殖的影響，結果顯示在80～240 μg/mL 的劑量范圍內，大金發(fā)蘚孢子體對U937 人急性粒細胞白血病的增殖抑制能力遠遠優(yōu)于其配子體(P＜0.01)(Fig.2K)。

3 討論

大金發(fā)蘚因具有藥用價值被歷代藥用典籍記載，近代學者對其化學成分進行研究，指出其中主要含二氧雜環(huán)己烷木質素，苯酚類化合物，甾醇酯類，蠟酯類，植醇酯，葉綠素，花生四烯酸，單糖基二甘油酯類，雙糖基二甘油酯類和脂類等［10-12］。本文對采自秦嶺南麓的大金發(fā)蘚化學成分進行初步研究，部分結果與文獻描述一致，同時確定大金發(fā)蘚中還存在生物堿、黃酮和皂苷類化合物。

對金發(fā)蘚屬的其他植物研究顯示，檜葉金發(fā)蘚的乙醇及酸提取物能使小鼠sarcoma 37 肉瘤壞死［5］;多形金發(fā)蘚和變形金發(fā)蘚中分離得到的8 種新型苯并萘并呫噸酮類化合物(benzonaphthoxanthenones)和2 種新結構的聯芐并苯乙烯醛基(cinnamoyl bibenzyls)化合物對9PS 小鼠白血病細胞和多種人類腫瘤細胞(A-549 肺癌、MCF-7 乳腺癌、HT-29 結腸癌、RPMI-7951 黑色素瘤和U-251 膠質瘤)均表現出細胞毒性，其中對白血病細胞的殺傷效應最為顯著［6，7］。此外，在1977年《本草綱目》(校點本)中也記載大金發(fā)蘚對淋巴細胞白血病具有一定抑制作用［3］。根據同屬植物化學成分種類相近的規(guī)律推測，大金發(fā)蘚中存在抗腫瘤化合物的可能性極大。這一推論在2009年被傅芃等人的研究結果證實，從大金發(fā)蘚中分離得到的2 種新化合物(S，E)-5-苯乙烯基-7-羥基二氫黃酮(communin B)和苯并萘并呫噸酮衍生物(ohioensin F)均能抑制A-549人肺癌腫瘤細胞株、LOVO 人腸癌細胞株、MDA-MB-435 人乳腺癌細胞株、HepG2 人肝癌細胞株和6TCEM 人T 細胞白血病細胞的增殖，其中，6T-CEM 人T 細胞白血病細胞對藥物處理最為敏感［12］。本文結果同樣證明大金發(fā)蘚乙醇提取物能夠對白血病細胞、人乳腺癌細胞、人鼻咽癌細胞、人結直腸癌細胞產生抗腫瘤活性，其中對白血病細胞的殺傷效應最強，這與已有文獻結果相符。同時，實驗結果顯示對L1210 白血病細胞產生明顯增殖抑制作用的藥物劑量卻未對正常細胞的生長產生影響，以上研究結果提示，大金發(fā)蘚在抗腫瘤特別是白血病治療中具有潛在應用價值。

苔蘚植物的生活史表現為配子體和孢子體的世代交替，其中配子體為具有單倍數染色體的小型綠色自養(yǎng)植物，而孢子體寄生于配子體上，通過基足攝取配子體的營養(yǎng)供給，保證具有2 倍數染色體的孢子正常發(fā)育。在生長過程中為抵御外界環(huán)境帶來的侵害而保證自身發(fā)育的需要，植物常常會產生并積累一些次生代謝產物，而這些次生代謝產物常具有重要的生理活性［13］。本文對大金發(fā)蘚進行有效成分提取的過程中發(fā)現其孢子體提取物得率大于配子體，推測孢子體中化學物質種類和含量均有可能高于其配子體，從而導致二者具有不同的生理活性。以體外培養(yǎng)的白血病細胞為考察對象的實驗結果證實了大金發(fā)蘚孢子體的抗腫瘤活性遠優(yōu)于其配子體。根據植物次生代謝物質生成規(guī)律結合苔蘚植物生活史推測，可能在大金發(fā)蘚孢子體形成過程中產生了一些特別的化學物質，并潴留于孢子體中，使得大金發(fā)蘚孢子體內化學物質的種類及含量與其配子體內略有不同，導致二者表現出的生理活性差異顯著。對其他植物類似的研究結果也表明，同一植物不同生長部位有效成分含量差異顯著。此外，藥典收錄同一種植物的不同部位記載為不同藥物的依據也是基于入藥部位所含化學成分種類的不同。若要明確大金發(fā)蘚孢子體及配子體抗腫瘤活性的差異，還有待于對其化學成分的進一步研究，用實驗數據來佐證推論。

1 Wu PC (吳鵬程)，Jia Y (賈渝).Flora Bryophytorum Sinicorum Vol.8 (中國苔蘚志.第八卷).Beijing:Science Press，2004.439-440.

2 Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences.Flora of Yunnan，Vol.19 (中國科學院昆明植物研究所編著，云南植物志，第十九卷).Beijing:Science Press，2005.628.

3 Li SZ (李時珍).Compendium of Materia Medica Vol.8 (本草綱目校點本，第2 冊).Beijing:People’s Medical Publishing House，1977.1412.

4 Chinese Materia Medica (中華本草).Shanghai:Shanghai Sciences Technology Publishing House，1999.22-23.

5 Belkin M，Fitzgerald DB.Tumor-damaging capacity of plant materialsⅡplants used as cathartics.J Nat Cancer Inst，1952，13:139-155.

6 Zheng GQ，Ching-jer C，Thomas JS，et al.Ohioensins:Novel Benzonaphthoxanthenones from Polytrichum ohioense.J Org Chem，1993，58:366-372.

7 Zheng GQ，David H，Patrick J，et al.Ohioensins and pallidisetins:novel cytotoxic agents from the moss Polytrichum pallidisetum.J Nat Prod，1994，57:32-41.

8 Chen YG (陳業(yè)高).Phytochemical (植物化學成分).Beijing:Chemical Industry Press，2004.

9 Cheng XX，Xiao YP，Wang XB，et al.Anti-tumor and pro-apoptotic activity of ethanolic extract and its various fractions from Polytrichum commune L.ex Hedw in L1210 cells.J Ethnopharmacol，2012，143:49-56.

10 Chen S (陳勝)，Zeng X (曾晞)，Ji XB (季祥彪)，et al.Study on chemical constituents of Polytrchum commune.Guizhou Chem Ind (貴州化工)，2008，33(5):29-32.

11 Chen S (陳勝)，Li M (李明)，Ji XB (季祥彪)，et al.Studies on the chemical components of Polytrichum commune.J Mountain Agric Biol (山地農業(yè)生物學報)，2008，2:279-282.

12 Fu P，Lin S，Shan L，et al.Constituents of the moss Polytrichum commune.J Nat Prod，2009，72:1335-1337.

13 Wink M.Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular phylogenetic perspective.Phytochemistry，2003，64:3-19.