陳繼新,劉天云,羅赤苗,張國(guó)華,陳嘉勤,鄭 核,賀小平(.南華大學(xué),湖南 衡陽(yáng) 00;.邵陽(yáng)市第一人民醫(yī)院外科;.邵陽(yáng)市中心醫(yī)院;.湖南師范大學(xué)體育學(xué)院)
肝癌是由遺傳和表觀遺傳改變而發(fā)生的惡性腫瘤[1]。目前,臨床上一般采取手術(shù)、放療、化療、生物治療、中藥治療以及綜合治療等療法。手術(shù)切除和肝移植仍是肝癌治療最佳方法,但由于肝臟腫瘤惡性程度高,進(jìn)展快,故臨床上就診患者約半數(shù)以上患者已為中晚期,且接受手術(shù)治療患者術(shù)后易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)。對(duì)于可手術(shù)的肝癌患者,術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移是影響治療效果及預(yù)后的主要因素,對(duì)于不能手術(shù)的中晚期肝癌患者尚缺乏有效的治療方法。因此,深入了解肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制,尋找新的治療手段對(duì)肝癌患者臨床治療有極為重要的意義。
雷氏大疣蛛毒素已被研究證實(shí)是由神經(jīng)毒性肽、蛋白質(zhì)和低分子量物質(zhì)所構(gòu)成的復(fù)雜混合物,具有多種活性[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn),雷氏大疣蛛毒可以抑制人肝癌BEL-7402、HepG2細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖[4-6]。其對(duì)多種癌細(xì)胞株增殖抑制作用的機(jī)制仍未明確。中醫(yī)藥在抗擊肝癌的過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用,從中藥中尋找有效的抗癌藥物是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)用的抗癌中藥由白花蛇舌草和半邊蓮等中草藥組成,具有清熱解毒、活血化瘀、提高機(jī)體免疫力等功效;對(duì)治療腫瘤則正虛邪實(shí),扶正固本與驅(qū)邪[7],其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。
RhoA(Ras homolog gene family,member A)是小分子Rho家族的一員,它在參與維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞的粘附作用及細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用。研究表明,RhoA在許多腫瘤中異常表達(dá),且促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的惡性化程度。Rho激酶(Rho associated kinase,ROCK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,約有1300個(gè)氨基酸殘基。ROCK是RhoA重要的效應(yīng)蛋白之一,通過(guò)對(duì)肌球蛋白輕鏈的磷酸化而參與細(xì)胞聚集、黏附和纖維收縮,轉(zhuǎn)染ROCK的癌細(xì)胞可不依賴于血清而產(chǎn)生侵襲特性。本研究采用雷氏大疣蛛毒和抗癌中藥干預(yù)的手段,通過(guò)HE染色觀察腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)觀察、免疫組織化學(xué)方法法檢測(cè)小鼠皮下移植的H22肝腫瘤組織中RhoA和ROCK等蛋白的表達(dá),探討其在H22肝腫瘤組織中的表達(dá)和理論意義,為肝癌患者預(yù)后判斷及臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
成年健康雄性昆明(KM)小鼠,體重18~22 g,由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):湘scxk2003-003)提供,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。將30只KM小鼠隨機(jī)均分為3組:模型組,雷氏大疣蛛毒素組和中藥組,每組10只。各組小鼠分籠飼養(yǎng),室溫23~25 ℃,相對(duì)濕度40~60%;自由進(jìn)食、飲水,采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料(湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)飼養(yǎng)。
1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建 模型組,雷氏大疣蛛毒素組和中藥組小鼠均參照皮下注射法[8]構(gòu)建皮下移植瘤模型。具體操作:將濃度為1×106個(gè)/mL小鼠H22肝癌腫瘤培養(yǎng)細(xì)胞懸液,接種于8只KM小鼠后頸部皮下,接種體積為0.5 mL/只。待瘤體長(zhǎng)至1~1.5 cm3時(shí)(15天左右),處死小鼠,選擇生長(zhǎng)良好的瘤組織,無(wú)菌條件下制成瘤細(xì)胞懸液(約每毫升含瘤細(xì)胞2×106個(gè)),每只小鼠后頸部皮下接種0.2 mL。
1.2.2 給藥方案 雷氏大疣蜘蛛毒素由湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院蛋白質(zhì)化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。臨用前取無(wú)菌生理鹽水按1∶10的比例稀釋,制成雷氏大疣蜘蛛毒素輸注液。建模成功后第三天開(kāi)始尾靜脈雷氏大疣蛛毒素,雷氏大疣蛛毒素組尾靜脈注射0.3 mL,連續(xù)給藥20天。中藥方劑組成:三棱6 g、莪術(shù)6 g、赤芍6 g、鱉甲5 g、當(dāng)歸6 g、川芎6 g、豬苓6 g、玄胡7 g、丹參7 g、紫草根6 g、白花蛇舌草12 g、半枝蓮12 g、蒲公英12 g、大黃3 g。藥液制備:用400 mL水浸泡,加熱煮沸,文火煎煮1 h,趁熱過(guò)濾;同法再煮2次,合并3次濾液,經(jīng)恒溫水浴濃縮至100 mL,4 ℃保存?zhèn)溆谩0慈伺c小鼠體表面積折算等效劑量經(jīng)口灌胃。中藥灌胃劑量0.4 mL/次,共6周。中藥組和雷氏大疣蜘蛛毒素組小鼠于術(shù)后3天開(kāi)始每天(下午6時(shí))干預(yù)。
1.2.3 試劑 RhoA、ROCK、P21、Bad、bcl-2一抗由武漢博士德生物工程有限公司提供,即用型二抗二抗即用型SABC小鼠/兔IgG、抗體稀釋液、DAB、DAB Kit、Poly-L-Lysine、快捷免疫組化、Tween20由福州邁新生物有限公司提供。0.9%氯化鈉注射液、甲醇、無(wú)水乙醇、多聚甲醛等常用分析純?cè)噭┚?gòu)于上?;瘜W(xué)試劑公司;10%水合氯醛購(gòu)自邵陽(yáng)市中心醫(yī)院。
1.2.4 樣品采集與處理 6周后各組小鼠禁食過(guò)夜,用10%的水合氯醛麻醉,頸椎脫臼處死。取出腫瘤組織并稱重,取部分新鮮腫瘤組織保存于液氮中,進(jìn)行總RNA提??;另一部分置于10%多聚甲醛溶液(0.1M,pH=7.4)中固定12小時(shí)以上,石蠟包埋、組織切片,HE染色觀察及免疫組化染色分析。
1.2.5 小鼠腫瘤體積測(cè)量 H22肝癌腫瘤細(xì)胞懸液接種后,每天觀察小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況,自可見(jiàn)皮下醬黑色腫塊突起(平均第3天)起,每4天測(cè)量1次腫瘤體積。用游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體的最長(zhǎng)徑(L)和最短徑(W),按公式(V=0.5236×L×W)計(jì)算各瘤體體積,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
1.2.6 病理學(xué)觀察 取厚3 μm石蠟切片,脫蠟、脫水,蘇木素和伊紅HE染色,脫水,透明、中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)。
1.2.7 免疫組織化學(xué)染色 采用SABC法免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)腫瘤組織RhoA/ROCK信號(hào)通路及相關(guān)細(xì)胞因子蛋白水平的差異表達(dá):多聚賴氨酸涂片,厚3 μm石蠟切片,高壓鍋沸騰檸檬酸熱抗原修復(fù),一抗(1∶500),室溫孵育1 h,PBS沖洗干凈,二抗(即用型SABC小鼠/兔IgG),室溫孵育30 min,PBS沖洗干凈,DAB顯色5~10 min,蘇木素復(fù)染1~3 min,Olympus(日本)顯微拍照。PBS代替一抗作陰性對(duì)照。用Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)(Leica公司,德國(guó))分析免疫組化陽(yáng)性產(chǎn)物面積,每張切片在200倍鏡下選取不相重疊的3個(gè)代表性視野,計(jì)算每個(gè)樣本的陽(yáng)性面積百分比(陽(yáng)性反應(yīng)面積/測(cè)量面積)。
1.2.8 質(zhì)量控制 動(dòng)物采用固定的飼養(yǎng)人員,實(shí)驗(yàn)取材、指標(biāo)檢測(cè)人員固定,以消除人員異動(dòng)引起的誤差。小鼠灌胃動(dòng)作要輕柔,從口角進(jìn)入,防止損傷食道。尾靜脈注射前要用酒精擦拭尾巴,擴(kuò)充血管;選擇進(jìn)針部位,遵循先遠(yuǎn)后近原則,以抽回血方式作為針進(jìn)入血管的標(biāo)志。
應(yīng)用SPSS19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用Excel軟件作圖。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn),P<0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
模型構(gòu)建過(guò)程中,各組未發(fā)生意外死亡情況。模型構(gòu)建成功后,小鼠食欲較正常,精神狀態(tài)尚可。隨腫瘤生長(zhǎng),小鼠食欲下降、精神狀態(tài)逐漸變差。雷氏大疣蛛毒素組和中藥組小鼠上述癥狀均輕于模型非干預(yù)組。
如表1顯示,小鼠測(cè)量數(shù)目為每組10只,腫瘤測(cè)量次數(shù)為10次,每4天測(cè)量一次。由表可見(jiàn):模型對(duì)照組腫瘤體積生長(zhǎng)速度最快,雷氏大疣蛛毒素干預(yù)組最慢,中藥干預(yù)組居間。自第2次測(cè)量開(kāi)始雷氏大疣蛛毒組與模型組體積出現(xiàn)差異(P<0.05),第3、第4次測(cè)量顯示中藥組、雷氏大疣蛛毒組與模型對(duì)照組相比有非常顯著性差異(P<0.01),且雷氏大疣蛛毒組與中藥組相比出現(xiàn)差異(P<0.05)及(P<0.01)。第5次測(cè)量結(jié)果顯示:與模型對(duì)照組相比中藥組、雷氏大疣蛛毒組均有顯著性差異(P<0.05),雷氏大疣蛛毒組與中藥組相比存在顯著性差異(P<0.05)。第6、7、8、9、10次測(cè)量結(jié)果均顯示中藥組、雷氏大疣蛛毒組與模型對(duì)照組相比存在非常顯著性差異(P<0.01),且雷氏大疣蛛毒組與中藥組相比存在非常顯著性差異(P<0.01)。
表1 三組小鼠腫瘤體積10次測(cè)量結(jié)果
HE染色結(jié)果(圖1)顯示:模型非干預(yù)組小鼠腫瘤細(xì)胞排列緊密、規(guī)整,核質(zhì)比較大,核染色深且異型性明顯。雷氏大疣蛛毒素組小鼠:細(xì)胞排列稀疏、欠規(guī)則,可見(jiàn)異型細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞核固縮,片狀空泡樣變性、壞死。壞死區(qū)面積大于低劑量組。中藥組:腫瘤細(xì)胞排列松散、無(wú)序,出現(xiàn)壞死區(qū),胞核較小、破壞不明顯,可見(jiàn)少量空泡樣變性。
圖1 三組小鼠腫瘤組織病理切片HE染色圖(×200)
從圖2可以看出:RhoA、ROCK表達(dá)定位于細(xì)胞漿,偶見(jiàn)細(xì)胞膜。p21表達(dá)定位于細(xì)胞核。RhoA、ROCK表達(dá)的強(qiáng)弱(棕黃色陽(yáng)性顆粒的散布程度)依次為模型組、抗癌中藥、雷氏大疣蛛毒素干預(yù)組。p21表達(dá)的強(qiáng)弱(棕黃色陽(yáng)性顆粒的散布程度)依次為雷氏大疣蛛毒素干預(yù)組、抗癌中藥組、模型組。
表2顯示,與模型非干預(yù)組相比較,雷氏大疣蛛毒素組p21表達(dá)最高,(P<0.01)。模型組RhoA、ROCK表達(dá)均最高,抗癌中藥組、雷氏大疣蛛毒素組表達(dá)與模型組相比較顯著降低(P<0.01)。且抗癌中藥組與雷氏大疣蛛毒素組比較差異有顯著性差異(P<0.01)。
腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移,首先要黏附于宿主細(xì)胞表面,再通過(guò)血液循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處。這個(gè)過(guò)程涉及多種基因產(chǎn)物之間的相互協(xié)調(diào)作用,其中重要的是調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、移動(dòng)、粘附的細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白[9]。RhoA是小分子G蛋白R(shí)ho家族的一員,被認(rèn)為與細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架的組裝和遷移有關(guān)[10-12]。在肝癌組織中,RhoA表達(dá)量增高,并且其過(guò)量表達(dá)與肝癌的分化程度、結(jié)節(jié)數(shù)目、有無(wú)靜脈浸潤(rùn)以及有無(wú)肝外轉(zhuǎn)移灶有關(guān)[13-14]。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,約有1300個(gè)氨基酸殘基。RhoA蛋白激活后,與ROCK的RBD結(jié)合將ROCK激活,同時(shí)發(fā)生定向轉(zhuǎn)位與肌球蛋白輕鏈(MLC)靠近。ROCK的激活本身可以將MLC磷酸化而發(fā)生肌絲收縮作用,同時(shí)MLCP是活化ROCK的底物,在接受RhoA/ROCK的活化信號(hào)后磷酸化,從而失活,阻止了磷酸化的MLC脫磷酸失活,使得胞漿內(nèi)磷酸化MLC水平提高,肌球-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)增加,促進(jìn)MLC磷酸化而促進(jìn)肌絲收縮在癌細(xì)胞的遷移中起主要作用[15]。此外,有研究顯示RhoA/ROCK蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞周期主要涉及在G1/S轉(zhuǎn)化過(guò)程[9]。
圖2 三組小鼠腫瘤組織中RhoA、ROCK、p21免疫組織化學(xué)染色結(jié)果(×200)
表2 三組小鼠免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性表達(dá)比較(%)
本實(shí)驗(yàn)中,抗癌中藥組和雷氏大疣蛛毒素組的RhoA、ROCK蛋白水平表達(dá)比模型非干預(yù)組明顯減少,提示中藥和雷氏大疣蛛毒素下調(diào)了RhoA、ROCK的含量,從而影響了RhoA/ROCK信號(hào)通路開(kāi)放,從而減緩了腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。
細(xì)胞周期進(jìn)展涉及多種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)的連續(xù)激活。p21蛋白是目前已知的具有最廣泛激酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白。p21可與幾乎每一個(gè)Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合,廣泛的抑制各種Cyclin-CDK復(fù)合物,使細(xì)胞停滯在G1期而抑制細(xì)胞增殖,還能結(jié)合并抑制細(xì)胞質(zhì)中的ROCK活性。p21不同區(qū)域?qū)?yīng)于不同的靶位,其N端結(jié)合并抑制Cyclin-CDK,而C段則結(jié)合PCNA,從而覆蓋PCNA的某些功能區(qū),使PCNA不能與DNA聚合酶D形成復(fù)合物,或使DNA全酶復(fù)合物不能在DNA單鏈上滑動(dòng),影響DNA復(fù)制。已有研究證明,p21的過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞周期阻滯于G1期、G2期或S期[16]。p21與腫瘤的分化、浸潤(rùn)深度、增生和轉(zhuǎn)移有關(guān),具有判斷預(yù)后的價(jià)值[17]。
抗癌中藥與雷氏大疣蛛毒素干預(yù)后,p21蛋白表達(dá)量較高,尤以雷氏大疣蛛毒素組表達(dá)最高。其作用機(jī)制可能是抗癌中藥和雷氏大疣蛛毒素提高了p21蛋白的含量,從而抑制了H22腫瘤的增殖。有研究顯示[18]雷氏大疣蛛毒素能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的可能機(jī)制之一是使p21基因和蛋白表達(dá)增加,G2/M細(xì)胞周期被阻滯,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,抗癌中藥、雷氏大疣蛛毒能有效的抑制小鼠H22肝癌組織的增殖,其中雷氏大疣蛛毒素的抑制作用更為顯著。雷氏大疣蛛毒素中的活性物質(zhì)可能通過(guò)間接維持細(xì)胞內(nèi)p21的含量,從而增強(qiáng)了對(duì)腫瘤增殖的抑制作用。
綜上所述,抗癌中藥及雷氏大疣蛛毒素,對(duì)小鼠皮下移植的H22肝腫瘤生長(zhǎng)和增殖有明顯的抑制作用,尤以后者效果更為顯著。其機(jī)制可能是雷氏大疣蛛毒素可能通過(guò)調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號(hào)通路中RhoA、ROCK和p21等相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),從而抑制了腫瘤的增殖。
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