錢振杰，張 恒，陳 敬

(珠海出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東珠海 519015)

唾液酸(Sialic Acid，SA)是一類神經(jīng)氨酸的衍生物，廣泛存在于多種生物組織中，主要包括N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)等。唾液酸主要的食物來源是母乳，也存在于牛奶、燕窩和雞蛋中［1］。在大部分哺乳動物組織中發(fā)現(xiàn)的唾液酸主要是N-乙酰神經(jīng)氨酸，其在乳中所占質(zhì)量比例可達(dá)到96%左右，因此通常把Neu5Ac稱為唾液酸［2］。唾液酸可通過提高大腦神經(jīng)細(xì)胞的信息傳遞速度促進(jìn)嬰兒的記憶力和智力發(fā)育，還可以提高兒童腸道吸收能力及兒童免疫力，所以部分嬰幼兒配方乳粉的生產(chǎn)廠家以此為商品的宣傳點(diǎn)，將其產(chǎn)品的唾液酸含量標(biāo)示于包裝之上，一般產(chǎn)品中唾液酸的含量在100～200 mg/100g之間。唾液酸的分析方法很多，主要有分光光度法［3］(UV)、薄層層析法［4］(TLC)、高效液相色譜法［5-7］(HPLC)、脈沖電化學(xué)高效陰離子交換色譜檢測法［8］(HPAE-PAD)、膠束電動色譜法［9］(MEC)、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［10］(CZE)以及高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［11］(HPLC-MS-MS)等。但是，尚沒有相關(guān)產(chǎn)品的相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用液相色譜法，對水解后的嬰幼兒配方乳粉中唾液酸總量的測定方法進(jìn)行研究，通過系統(tǒng)優(yōu)化試樣水解、衍生和測定條件，建立乳粉中唾液酸含量測定的液相色譜法。該方法對嬰幼兒配方乳粉中唾液酸的檢測和標(biāo)示值的確定具有較好的指導(dǎo)意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

e2695型液相色譜儀，配2475熒光檢測器(美國 Waters);分析天平(瑞士 梅特勒-托利多);HS250 Basic型多功能振蕩器(德國 IKA);HHS21-8-S恒溫水浴鍋(上海新苗)。

1.2 材料與試劑

N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)(含量＞98%，標(biāo)準(zhǔn)品);乙腈、四氫呋喃(色譜純);鄰苯二胺(OPD)、硫酸、氫氧化鈉、硫酸氫鈉及磷酸(分析純);實(shí)驗用水為符合GB6682-2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的一級水。

2 實(shí)驗方法

2.1 樣品溶液的制備

稱取約0.2 g～0.3 g(精確至0.001 g)樣品，置于25 mL比色管中，加入20.0 mL硫酸溶液(0.1 mol/L)，充分振蕩搖勻，置于80℃下水浴2 h，冷卻，加入0.625 mL氫氧化鈉溶液(6.0 mol/L)調(diào)節(jié)pH至近中性，加水定容，搖勻后靜置3 h，直至上層澄清。

2.2 衍生反應(yīng)

吸取水解后的上層清液1.00 mL置于15 mL離心管中，再加入1.0 mL濃度為5 mg/mL鄰苯二胺溶液(用0.1 mol/L硫酸氫鈉配制)，搖勻后置于80℃水浴下衍生50 min，冷卻，并用0.2 μm一次性針頭式濾頭過濾，裝瓶待測。

2.3 色譜條件

Agilent SB-AQ C18色譜柱(150mm ×4.6mm，5μm);流動相A:乙腈，流動相B相:1%四氫呋喃水溶液(含0.2%磷酸)皆為體積比;柱溫:30℃;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;熒光檢測器激發(fā)波長:231 nm，發(fā)射波長:465 nm。梯度洗脫程序如下:0 min(8% 流動相A)-5 min(8% 流動相A)-10 min(30%流動相A)-12 min(30%流動相A)-12.1 min(8%流動相A)-18 min(8% 流動相A)。

在上述色譜條件下，唾液酸的參考保留時間為8.35 min。樣品溶液的唾液酸液相色譜如圖1所示。

圖1 唾液酸樣品溶液液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of sialic acid sample solution

2.4 線性范圍

分別吸取1.00 mL唾液酸標(biāo)準(zhǔn)工作液系列于15 mL離心管中，按2.2步驟衍生，冷卻過濾，上機(jī)檢測。以標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖2。標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.00 μg/mL ～60.0 μg/mL線性范圍之內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=4 915x-1 645.3，相關(guān)系數(shù)r2為0.999 8。

圖2 唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線Fig.2 Standard curves of Sialic acid

2.5 精密度試驗

對嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行了6次平行測定，含量及精密度結(jié)果如表1所示。此外，通過測定6次平行測定峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)與標(biāo)準(zhǔn)曲線方程斜率(k)的比值，我們可得出3倍信噪比(3SD/k)為8.46 mg/100g，故將本方法的檢測限定為10.0 mg/100 g。

表1 唾液酸在乳粉樣品中的本底值的測定Tab．1 Determination results of samples

2.6 加標(biāo)回收率試驗

取已知含量的嬰幼兒配方乳粉樣品分別加入低、中、高3個濃度水平的N-乙酰神經(jīng)氨酸對照品溶液。按上述方法進(jìn)行添加回收實(shí)驗，計算3個加標(biāo)水平的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。

表2 唾液酸在乳粉中的實(shí)驗室內(nèi)回收率和精密度數(shù)據(jù)Tab．2 Spike recovery rates of sialic acid in milk powder

3 結(jié)果與討論

3.1 水解條件的選擇

乳及乳品中的唾液酸主要以3種形式存在:游離態(tài)、蛋白結(jié)合態(tài)以及低聚糖結(jié)合態(tài)。本研究使用稀硫酸對樣品中所含唾液酸進(jìn)行水解處理。不同水解時間下待測物的含量結(jié)果如圖3所示，60～120 min時間范圍內(nèi)測定結(jié)果基本保持穩(wěn)定，故本方法選擇水解時間為120 min，以避免乳粉水解不完全的現(xiàn)象發(fā)生。

3.2 衍生劑濃度對實(shí)驗的影響

唾液酸屬于九碳糖類物質(zhì)，無紫外吸收峰，但在酸性條件下可與OPD反應(yīng)，生成有熒光性質(zhì)的衍生物。唾液酸與鄰苯二胺的衍生反應(yīng)機(jī)理如圖4所示。

本研究針對不同濃度衍生劑存在下待測物的含量進(jìn)行分析測定，結(jié)果如圖5所示。實(shí)驗發(fā)現(xiàn)高濃度的衍生劑有利于衍生反應(yīng)正向進(jìn)行，但同時過多存在的衍生劑也會造成色譜峰拖尾，影響目標(biāo)物質(zhì)的分離，故本方法選擇濃度為5 mg/mL的鄰苯二胺為衍生劑進(jìn)行反應(yīng)。

圖3 不同水解時間對測定結(jié)果的影響Fig.3 Effect of different hydrolysis times

圖4 唾液酸和OPD的衍生反應(yīng)機(jī)理圖Fig.4 Derivatization principles of Sialic acid and OPD

圖5 不同衍生劑濃度對測定結(jié)果的影響Fig.5 Effect of different Derivative concentration

3.3 衍生時間對實(shí)驗的影響

衍生時間對測定結(jié)果的影響如圖6所示。實(shí)驗結(jié)果表明，衍生時間在40 min之前待測物峰面積隨時間增加不斷增大，當(dāng)時間超過60 min后則出現(xiàn)略微的下降。因此，最終選擇50 min作為最佳衍生時間。

圖6 不同衍生時間對測定結(jié)果的影響Fig.6 Effect of different derivative time

3.4 色譜條件的選擇

使用熒光分光光度計對衍生產(chǎn)物進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果如圖7所示。最終我們選擇231 nm作為激發(fā)波長，465 nm作為發(fā)射波長對衍生產(chǎn)物進(jìn)行分析。

圖7 熒光檢測器條件的選擇Fig.7 The instrument conditions of Fluorescence detector

4 結(jié)論

本研究建立了嬰幼兒配方乳粉的柱前衍生熒光液相色譜檢測方法，對檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化并對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行驗證。該方法快速、簡便，選擇性和準(zhǔn)確性高、靈敏度和精密度也滿足實(shí)際工作需要，適用于嬰幼兒配方乳粉中唾液酸總量的測定。本方法可作為市售嬰幼兒配方乳粉中唾液酸標(biāo)簽值正確與否的確認(rèn)方法，具有很高的實(shí)用性。

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