摘 要：飲用水中微生物污染不斷出現(xiàn)，對(duì)檢測(cè)技術(shù)提出了新的挑戰(zhàn)。作者介紹了目前飲用水中病原微生物的種類、危害及我國(guó)飲用水微生物指標(biāo)，對(duì)病原微生物的檢測(cè)方法進(jìn)行了歸納，探討了長(zhǎng)壽命熒光探針技術(shù)在飲用水中病原微生物檢測(cè)的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)壽命熒光探針 飲用水 病原微生物

中圖分類號(hào)：X835 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2013）07（c）-0132-01

環(huán)境水體的污染，直接影響著飲用水的質(zhì)量，隨著水體生物污染的出現(xiàn)，給飲用水的安全問(wèn)題提出了新的挑戰(zhàn)。飲用水中微生物，特別是病原體微生物的出現(xiàn)，給人類的生命安全帶了隱患，如2003年SARS冠狀病毒[1]等全球性生物污染的出現(xiàn)，使飲用水中病原微生物的檢測(cè)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。

1 飲用水中常見(jiàn)的病原微生物

飲用水中有許多微生物，絕大部分微生物都是無(wú)害的，引起安全問(wèn)題的主要是致病微生物，主要包括細(xì)菌、病毒、藻類、原生動(dòng)物。細(xì)菌中常見(jiàn)的主要有傷寒桿菌、軍團(tuán)菌、病原性大腸桿菌、鳥(niǎo)分歧桿菌復(fù)合群、螺桿菌、彎曲桿菌、霍亂桿菌等。常見(jiàn)病毒有腸道病毒、肝炎病毒、輪狀病毒、兔杯狀病毒等。有些藻類能產(chǎn)生肝毒素、神經(jīng)毒素等，特別是研究發(fā)現(xiàn)飲用水中微囊藻毒素與肝癌發(fā)病率高度相關(guān)。原生動(dòng)物主要有賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)、環(huán)孢子蟲(chóng)和微孢子蟲(chóng)，它們能引起人的腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)生命危險(xiǎn)。

2 我國(guó)的飲用水微生物指標(biāo)

目前，世界各國(guó)無(wú)論是發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家，都把飲用水中微生物問(wèn)題列在首位[2]。也制定了相關(guān)飲用水中微生物的指標(biāo)：總的來(lái)說(shuō)，發(fā)達(dá)國(guó)家的指標(biāo)中微生物的種類要更多，要求更嚴(yán)格。這也是飲用水中微生物指標(biāo)的發(fā)展趨勢(shì)。中國(guó)目前以2006年頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，共6項(xiàng)微生物指標(biāo)，包括微生物項(xiàng)目細(xì)菌總數(shù)、大腸桿菌、賈第鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)、大腸埃希菌和耐熱大腸菌群。可以看到，我國(guó)對(duì)病毒和產(chǎn)毒藻類并沒(méi)有強(qiáng)制的標(biāo)準(zhǔn)，需要在不斷的發(fā)展中修訂我國(guó)的飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。

3 飲用水中微生物檢測(cè)方法

隨著飲用水中微生物指標(biāo)地不斷修訂，飲用水中微生物的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法也在不斷的更新發(fā)展[3]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測(cè)方法主要包括：菌落總數(shù)的平板計(jì)數(shù)法，總大腸桿菌和大腸埃希氏菌的多管發(fā)酵法、濾膜法、酶底物法，耐熱大腸菌群的多管發(fā)酵法、濾膜法，賈第鞭毛蟲(chóng)和隱孢子蟲(chóng)的分子生物學(xué)方法。細(xì)菌的傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法被一度認(rèn)為是經(jīng)典的微生物檢測(cè)方法，在我國(guó)也一直沿用至今，該方法成本低、對(duì)實(shí)驗(yàn)室的硬件要求也不高，但是這種方法費(fèi)時(shí)，而且對(duì)檢測(cè)人員的要求也比較高。對(duì)于原生生物的檢測(cè)也存在著方法操作復(fù)雜、檢出率低、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。

免疫學(xué)技術(shù)特別是酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定已經(jīng)成功地用來(lái)檢測(cè)甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，相關(guān)的檢測(cè)試劑盒也已經(jīng)商業(yè)化。免疫學(xué)技術(shù)比傳統(tǒng)的方法在時(shí)間上縮短了很多，但是也存在一些不足：抗體制作困難，結(jié)果受到洗滌、抗原包被過(guò)程的影響很大；另外，針對(duì)變異性快的病毒，免疫學(xué)檢測(cè)就比較困難，抗體容易失效，不能檢測(cè)新的抗原。

分子生物學(xué)的發(fā)展，是人們對(duì)微生物的檢測(cè)也發(fā)展到了分子水平。主要出現(xiàn)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)和基因芯片技術(shù)。PCR技術(shù)由于其高靈敏度和特異性等特點(diǎn)得到了廣泛的應(yīng)用，也衍生出了多種檢測(cè)方法，包括熒光定量PCR、免疫PCR等。PCR反應(yīng)容易受到環(huán)境中一些物質(zhì)的干擾而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，并且需要得到純化的DNA或RNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，步驟多，儀器昂貴，對(duì)操作人員的要求也高。FISH技術(shù)是一種安全、快速、靈敏度較高的技術(shù)，但成本較高，難以普及應(yīng)用。基因芯片技術(shù)起步較晚，還不是很完善，在特異性、樣品制備等方面還存在許多問(wèn)題，而且成本也比較高。這些方法還容易受到生物體系內(nèi)源熒光背景和固體基質(zhì)背景的干擾，檢測(cè)時(shí)靈敏度的提高受到限制。

另外，還出現(xiàn)了流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)新技術(shù)[4]，該技術(shù)縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且能區(qū)分活性和非活性細(xì)菌，以及估算微生物的再生能力。但是也存在一定的假陽(yáng)性和假陰性率，并且使用不同熒光染料或者內(nèi)標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也明顯有差異，檢測(cè)費(fèi)用也比較昂貴。

4 長(zhǎng)壽命熒光標(biāo)記技術(shù)

熒光分析法是一種先進(jìn)的分析方法，具有儀器構(gòu)造簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)而不斷地被應(yīng)用在各種分析檢驗(yàn)過(guò)程中?；跓晒夥治鲈淼臒晒馓结樇夹g(shù)在生命科學(xué)等領(lǐng)域已經(jīng)起著舉足輕重的作用，由于其在檢測(cè)速度和易用性方面具有無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)，在很多方面已經(jīng)取代放射性核素標(biāo)記技術(shù)而稱為標(biāo)準(zhǔn)的方法。但是熒光標(biāo)記法有個(gè)最大的問(wèn)題就是熒光探針容易受到生物體內(nèi)源熒光和固體基質(zhì)背景熒光的干擾。

長(zhǎng)壽命熒光技術(shù)可以利用時(shí)間分辨的方法來(lái)消除內(nèi)源熒光和干擾熒光，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注而迅速發(fā)展。從20世紀(jì)80年代起，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。在微生物檢測(cè)方面，長(zhǎng)壽命熒光標(biāo)記技術(shù)也嶄露頭角，已用于快速測(cè)定食品中的大腸桿菌、微囊藻毒素、赭曲霉素A。Niu等以功能性長(zhǎng)壽命稀土銪配合物為標(biāo)記物，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為例，建立了基于固體基質(zhì)表面的雙探針串聯(lián)雜交模型，用于病原微生物DNA的檢測(cè)，并成功地對(duì)環(huán)境樣品中病源微生物進(jìn)行了測(cè)定。將長(zhǎng)壽命熒光探針技術(shù)構(gòu)建高穩(wěn)定性、高靈敏度、快速、簡(jiǎn)便的飲用水中病原微生物的檢測(cè)具有重要的理論與實(shí)際意義。

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