膠原蛋白的概念

膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，占人體全身總蛋白質(zhì)的25%～30%，廣泛地存在于人體的皮膚、骨骼、肌肉、軟骨、關(guān)節(jié)、頭發(fā)組織中，起著支撐、修復(fù)、保護(hù)三重抗衰老作用。膠原蛋白的特性決定了其在化妝品上的優(yōu)良功效，具有良好的應(yīng)用前景。

1.膠原蛋白的來源

一般來說，膠原蛋白的主要來源是陸生動物，如豬、牛、羊等，主要分布于生皮中，其次是骨頭和肌肉中。脊椎動物體內(nèi)的膠原蛋白量是結(jié)構(gòu)蛋白的主要成分，是結(jié)締組織和支持組織的主要組成部分。近年隨著瘋牛病、口蹄疫等疾病的肆虐和一些宗教信仰等原因，使得人們對于牲畜膠原制品的安全性產(chǎn)生質(zhì)疑，所以作為牲畜替代原料的水產(chǎn)動物—魚類引起了人們的廣泛關(guān)注。

對于魚類中膠原蛋白的提取，其實(shí)主要可利用魚的下腳料，它有三大優(yōu)勢：第一，魚膠原的可溶性比陸生動物高，更有利于組織吸收[1]，且其抗原性和過敏性較低，分子結(jié)構(gòu)較脆弱方便酶解[2]，故從魚中提取膠原蛋白較從其他動物中提取工藝更簡單，節(jié)約成本；第二，研究表明，由魚下腳料中提取的膠原蛋白所制得的多肽分子量大部分都在1000D以下，對皮膚的滲透性好，下腳料中魚皮的膠原蛋白含量最高可達(dá)80%以上，較魚體其他部位高許多[3]，因此從得率考慮，從魚皮中提取膠原蛋白具有重要的經(jīng)濟(jì)意義；第三，充分利用魚類加工的副產(chǎn)品，這是一種新型膠原資源的開發(fā)，不僅節(jié)約資源而且增加其附加值，膠原蛋白的回收率更是高達(dá)90%以上。劉克海、秦玉清[4]等研究表明，從魷魚皮中提取的膠原蛋白保濕率明顯高于丙二醇和甘油。

2.膠原蛋白的基本結(jié)構(gòu)

膠原蛋白在體內(nèi)以膠原原纖維的形式存在，其基本組成單位是原膠原分子，微觀結(jié)構(gòu)如圖1所示。膠原蛋白的分子量為300KD，它是由3條左手螺旋的a肽鏈組成，這3條鏈相互纏繞形成右手螺旋結(jié)構(gòu)。另外，肽鏈間的范德華力、氫鍵和共價(jià)交聯(lián)鍵是維持膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力[5]。

A—電鏡下膠原纖維呈明暗交替的條紋圖案；

B—膠原纖維中膠原原分子的排列；

C—原膠原分子式一種右手三股螺旋；

D—三股螺旋中的每股鏈?zhǔn)亲笫致菪?/p>

E—三股螺旋的原分子水平模型

膠原一級結(jié)構(gòu)（肽鏈）均為（Gly- X-Y）重復(fù)序列，其中甘氨酸約占氨基酸總量的1/3，其次是膠原所特有的脯氨酸和羥脯氨酸，含量高達(dá)15%～30%，色氨酸、酪氨酸及蛋氨酸等必需氨基酸含量低[7]。膠原蛋白良好的保濕性能就是源于其所富含的大量氨基、羧基、羥基等親水基團(tuán)。

3.皮膚中的膠原蛋白

膠原蛋白位于皮膚的真皮層，含量約為70%，主要包括Ⅰ型（85%）、Ⅲ型和Ⅴ型，這三類都屬于纖維狀膠原，它們相互交叉形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使皮膚具有很強(qiáng)的抗張性和彈性[8]。而皮膚衰老的主要原因就是隨著年齡的增長，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，皮膚含水量逐漸降低，纖維細(xì)胞的合成膠原蛋白能力下降。皮膚中一旦缺乏膠原蛋白，膠原纖維就會發(fā)生交聯(lián)固化，使細(xì)胞間粘多糖減少，皮膚就會失去彈性并變薄老化。另外，皮膚中膠原蛋白還會受到生活習(xí)慣、外界環(huán)境（如紫外線）的影響，紫外線會促進(jìn)皮膚老化，并且人的體內(nèi)會發(fā)生氧化作用，膠原蛋白的彈性纖維結(jié)構(gòu)會因自由基的攻擊產(chǎn)生變形從而失去原有的彈性，皮膚就會變得粗糙并產(chǎn)生皺紋[9]。

膠原蛋白在化妝品中的功效

將膠原蛋白添加到化妝品中，能為皮膚提供必需的營養(yǎng)成分，其所含大量的親水基團(tuán)使之具有良好的保濕功效，另外，膠原蛋白還能起到穩(wěn)定泡沫、調(diào)節(jié)和穩(wěn)定pH值、乳化膠體的作用，減輕各種表面活性劑及酸、堿等刺激性物質(zhì)對皮膚和毛發(fā)的損害[10]， 膠原蛋白在化妝品中的顯著功效主要體現(xiàn)在以下幾個方面[11]。

1.保濕

因?yàn)槟z原蛋白與皮膚角質(zhì)層的結(jié)構(gòu)相近，故與皮膚有很好的相容性，能滲透進(jìn)皮膚表皮層，膠原蛋白中含有的大量親水基團(tuán)與角質(zhì)層中的水結(jié)合，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，鎖住水分使之具有良好的保濕功效，起到天然保濕因子的作用。

2.抗皺

皺紋之所以出現(xiàn)主要是因?yàn)槠つw真皮層中膠原蛋白含量的減少，小分子量的膠原蛋白能透過皮膚表皮層，在皮膚基質(zhì)中起到填充作用，增加皮膚張力，使得肌膚更有彈性，舒緩皺紋。

3.美白

人的皮膚顏色主要是由黑色素的分布與含量決定的。黑色素的主要成分是醌型聚合物，黑色素產(chǎn)生的原因是酪氨酸酶與皮膚中的酪氨酸反應(yīng)，生成多巴醌，釋放出黑色素?；瘖y品中添加的膠原多肽的酪氨酸殘基會與皮膚中的酪氨酸競爭與酪氨酸酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酪氨酸酶催化酪氨酸，阻止皮膚中黑色素的形成，達(dá)到美白作用[9]。

4.修復(fù)

膠原蛋白還可以用來皮下注射，起到支撐和填充的作用，并提供良好的營養(yǎng)，有利于上皮細(xì)胞的增生修復(fù)，從而誘導(dǎo)皮膚組織的構(gòu)建，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，起到矯形的作用。同時也可用于減少皺紋和消除皮膚疤痕，使疤痕軟化，并能逐漸被組織吸收而消退。

膠原蛋白的水解方法

膠原蛋白本身的分子量很大，用于化妝品時需將其水解成小分子量的多肽才能被皮膚吸收，因此膠原蛋白的水解方法適當(dāng)對膠原蛋白的功效就顯得十分重要。研究表明，對化妝品中的膠原蛋白水解物分子量的要求一般為1000～5000Da，平均分子量為700～1000Da時效果最佳；分子量為2000左右的水解物能被頭發(fā)充分吸收，效果最好?？扇苄阅z原能在皮膚上形成光滑、柔和的膜，從而不僅具有吸

濕性而且能夠抑制水分揮發(fā)[12]。膠原水解一般有兩種方法：使用酸、堿的化學(xué)降解法和使用酶的生物降解法。

1.酸法提取

酸法提取即利用酸浸泡預(yù)處理后的材料，使膠原蛋白部分降解后釋放到溶劑中，再通過離心等操作提純的方法。常用的酸有乙酸、草酸、檸檬酸、鹽酸和乳酸等，膠原水解產(chǎn)物的分子量隨水解溫度、酸的濃度和水解時間等條件的不同而不同。該法的優(yōu)點(diǎn)是水解迅速徹底，分子量分布廣；缺點(diǎn)是在水解過程中色氨酸全部被破壞，酪氨酸和絲氨酸部分被破壞，產(chǎn)品得率低且腐蝕設(shè)備、污染嚴(yán)重[13]。

2.堿法提取

同酸法提取類似，堿法提取不過是用堿溶解預(yù)處理后的材料從中提取膠原。膠原水解物的分子量受水解溫度和時間、堿的濃度等條件的影響而不同。該法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便；缺點(diǎn)是使膠原中含巰基和羥基的氨基酸全部被破壞且產(chǎn)生消旋而變成有毒物質(zhì)，提取率較其他提取方法低[14]。Kolodziejska等[15]用NaOH從魷魚皮中提取堿溶性膠原蛋白，得率只有3%（以濕基計(jì)）。

3.酶法提取

酶法提取是在預(yù)處理后的材料中加入酶制劑，即用蛋白酶來溶解膠原從而達(dá)到提取的目的，水解原理如圖2所示。常用的酶有胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及復(fù)合酶等。對酶的選擇通常要考慮兩個因素，一是酶對膠原作用的強(qiáng)弱及酶的價(jià)格，另一個則是酶對膠原的作用位點(diǎn)（按作用點(diǎn)不同可分為內(nèi)切酶和外切酶），這將直接影響到水解產(chǎn)物的分子量分布。目前酶解膠原蛋白主要有單酶水解和多酶水解兩種方法，后者又分為分步酶水解和混合酶水解，多酶水解則適用于獲取較小分子量的膠原多肽[16]。影響酶法提取的主要因素有酶的種類和用量、液料比、pH值、水解時間以及水解溫度。另外，由于酶的專一性，酶解產(chǎn)物的分子量不是連續(xù)分布，主要集中在一個較窄的區(qū)域，故選擇適當(dāng)?shù)拿负凸に嚄l件，理論上可以得到預(yù)期相對分子質(zhì)量的水解產(chǎn)物。多酶協(xié)同和混合交替法可實(shí)現(xiàn)膠原的高效定向水解，并能最大程度地保留產(chǎn)物的生物活性，故此法是膠原控制水解的一個重要發(fā)展方向[17]。韓鳳杰等[18]用2709堿性蛋白酶處理比目魚皮膠原，得到其膠原寡肽分子量主要分布在0.6～1.8KD。Cabeza L F等人[19]用兩步酶法（先用胃蛋白酶提取，再用堿性蛋白酶提?。┨崛煞N不同的膠原水解產(chǎn)物。

化學(xué)降解法由于自身的諸多缺點(diǎn)如腐蝕設(shè)備、破壞氨基酸、改變產(chǎn)物結(jié)構(gòu)等而被逐漸淘汰，而酶法因其特有的選擇性、無污染性、條件溫和、提取的膠原蛋白性質(zhì)穩(wěn)定且分子量較小等而被廣泛采用。

膠原水解產(chǎn)物分子量的檢測

事實(shí)上膠原水解產(chǎn)物的成分比較復(fù)雜，分子量分布較廣，包括大分子的蛋白質(zhì)和小分子的氨基酸、多肽等，因此人們對膠原多肽分子量的控制手段以及分子量的檢測方法給予了高度關(guān)注，將現(xiàn)代分析檢測方法用于膠原蛋白的水解過程，成為膠原蛋白應(yīng)用研究的一個重要方面。

1.凝膠過濾色譜法（GPC）

凝膠色譜法是根據(jù)溶劑分子尺寸的不同進(jìn)行分離的一種液相色譜法，以水作為流動相，分子的分離在填充有一定孔徑范圍的多孔凝膠的色譜柱中進(jìn)行，利用高分子溶液通過該色譜柱時將聚合物分子按尺寸大小進(jìn)行分離，分子按從大到小的順序排出，再逐步被檢測器測出[21]。分子量的測定范圍隨著凝膠的不同而不同，從幾千到幾千萬。A Ritter[22]等使用 GPC（SEC）法通過循環(huán)測試程序測試了六種不同物質(zhì)的平均分子量，其測定結(jié)果重復(fù)性很好。

2.十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS-PAGE）凝膠電泳法

SDS-PAGE法的原理是SDS與膠原蛋白的疏水部分充分結(jié)合，破壞其折疊結(jié)構(gòu)，形成棒狀的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS膠束，使膠原蛋白能穩(wěn)定存在于廣泛均一的溶液中，故該法是根據(jù)蛋白質(zhì)的分子形狀和大小來進(jìn)行分離[23]。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：lgM=k-bx，其中M為分子量，x為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。Cohen等[24]采用SDS- PAGE分離和測試蛋白質(zhì)和多肽的分子量。該法由于對樣品需求量較大、操作過程繁瑣、重現(xiàn)性較差等原因而逐漸被其他先進(jìn)技術(shù)所取代。

3.高效液相色譜與電噴霧-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-ESI-MS）

ESI是通過強(qiáng)電場使分子分離，ESI/MS譜峰的積分強(qiáng)度與樣品在溶液中的濃度成正比，所以從質(zhì)譜圖上也可以獲取各組分的相對含量[25]。電噴霧質(zhì)譜適宜測10～200kDa分子量范圍的蛋白質(zhì)，且只需Pmol量的蛋白質(zhì)樣品，不僅快速靈敏，而且測量精確度高（0.1%～0.01%），Green等[26]采用ESI-MS對質(zhì)量差別很小的蛋白質(zhì)分子進(jìn)行區(qū)分和檢測，顯示了質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分子測量上的優(yōu)勢。但它的測定成本相對較高，故不宜用做實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測。

4.多角度激光光散射-凝膠滲透色譜法

（MALLS/GPC）

該法先是將高分子物質(zhì)用凝膠滲透色譜儀進(jìn)行分離，再通過濃度檢測器和多角度激光光散射檢測器同時檢測出各組分的濃度和分子量，將兩者的信號輸出并用記錄儀記錄后即得各組分的絕對分子量和反映分子量分布的凝膠色譜曲線[27]。由于光散射信號與分子量大小直接相關(guān)，因此不需要結(jié)構(gòu)相似的標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線即可以直接測出重均分子量，并獲得其他相關(guān)信息，故被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、高分子化學(xué)等研究領(lǐng)域。理論上GPC-MALLS可以測定的分子量范圍很廣[28，29]，可達(dá)103～107。Hongping Ye[30]利用GPC-MALLS同時測定了蛋白質(zhì)的聚集、降解和絕對分子質(zhì)量。它的缺點(diǎn)在于對分子形狀要求較高，只有在標(biāo)樣與待測樣的分子形狀一致時測量結(jié)果才較為準(zhǔn)確，否則誤差較大，因此在不知道蛋白質(zhì)分子形狀時不建議使用。

5.基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法

（MALDI-TOF-MS）

該法原理是當(dāng)用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，基質(zhì)—樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測器飛行時間的不同而被檢測，即測定離子的質(zhì)量電荷之比與離子的飛行時間成正比來檢測離子。MALDI-TOF-MS的核心技術(shù)就是將樣品成分轉(zhuǎn)換成離子信號，依據(jù)質(zhì)荷比（m/z）的不同來進(jìn)行檢測，以判斷其源自哪一個蛋白質(zhì)[31]。它具有分辨率高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高（0.1%～0.01%）、圖譜簡明、靈敏度高、樣品用量少等傳統(tǒng)測量方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，適用于混合物及蛋白質(zhì)等生物大分子的測定，成為許多實(shí)驗(yàn)室的首選蛋白質(zhì)譜鑒定方法，可測定的分子量高達(dá)600KD。

縱觀以上幾種方法的優(yōu)缺點(diǎn)，結(jié)合對添加于化妝品中的膠原蛋白的嚴(yán)格要求，檢測膠原蛋白分子量的最佳方法是基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜法。

膠原蛋白的研發(fā)和應(yīng)用前景

膠原蛋白在不同性質(zhì)的化妝品中要求也不同，油性化妝品中添加的膠原多肽要求水解程度較低、分子量較大，這樣相對疏水作用較強(qiáng)，具有較好的吸油性和乳化性；保濕型化妝品則需要酶解程度較高、分子量較小的膠原多肽，因其極性基團(tuán)能形成離子鍵、氫鍵等作用力，有較好的吸水性和保水性[32]。如日本Jelice Co. Ltd.公司制備的膠原最小單元膠原三肽（Colagen Tripeptide，簡稱為CTP），它的平均分子量很小，約為280Da，具有優(yōu)良的滲透性，能促進(jìn)真皮層中成纖維細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的合成，將其添加于化妝品中，會對皮膚的濕潤性、彈性和改善皮膚粗糙產(chǎn)生顯著的效果[33]。法國Russelot公司從豬、牛、魚皮和骨骼中提取并生產(chǎn)的Peptan水解膠原蛋白，它的分子量為2000～5000Da，含有9種必需氨基酸中的8種，其中甘氨酸、羥脯氨酸/脯氨酸和谷氨酸含量非常高，占氨基酸總量的50%以上，不僅應(yīng)用于化妝品中有良好的功效還可用來口服[34]。北京奧通精細(xì)化工高科技公司生產(chǎn)的高純度的100%純天然活性蛋白—鮮膠原蛋白，對人體無毒、無刺激、無副作用，安全性極高，是天然化妝品中的高科技產(chǎn)品，代表了生物化妝品的發(fā)展方向[35]。

對于添加于化妝品中的膠原蛋白較其他用途的膠原蛋白要求更加嚴(yán)格，包括來源、提取和對分子量的控制。雖然目前膠原蛋白的來源和提取方法已經(jīng)基本確定，但是對于如何得到更加純凈、安全的膠原蛋白依然是今后的重點(diǎn)研究方向，例如科學(xué)家通過基因工程發(fā)酵技術(shù)合成了類人膠原蛋白，與動物膠原蛋白比較，它的水溶性更好、無病毒隱患、具有可加工性、排異反應(yīng)低等優(yōu)點(diǎn)，成為近幾年研究熱點(diǎn)[36]；還有從蠶絲中提取的全天然純絲膠蛋白，它具有獨(dú)特的皮膚保濕、營養(yǎng)、穩(wěn)定乳化、抗氧化、抗衰老、抗菌消炎等特殊功能，應(yīng)用前景非常廣闊[37]。另外，在膠原蛋白的提取方面，如何提高產(chǎn)率和純度、縮短提取時間以及過程的綠色化也是未來的研究熱點(diǎn)。

作者單位

錢 潔 程寶箴：天津科技大學(xué) 材料科學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院

王巧娥：北京工商大學(xué) 北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室