彭繼慶，曹福祥，范海燕

（中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004）

博白大果油茶遺傳多樣性的ISSR研究

彭繼慶，曹福祥，范海燕

（中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術學院，湖南 長沙 410004）

利用ISSR分子標記技術，對博白大果油茶2個天然種群和2個人工種群進行遺傳多樣性研究，表明博白大果油茶種水平具有較高的遺傳多樣性，種群的變異主要來自于種群內(nèi)部，種群間分化程度比較低，各個種群沿著共同方向進化。種群間基因流（Nm）為1.195 4，大于1，足以抵制遺傳漂變的作用。聚類分析表明人工種群引種于廣西江寧。人工種群和天然種群相比，遺傳多樣性水平略有降低，但總體差別不大，說明人工種群已經(jīng)適應了栽培地的氣候特征。

博白大果油茶，遺傳多樣性，ISSR

博白大果油茶Camellia gigantocarpa Hu et Huang又名赤柏子，山茶科山茶屬常綠喬木，1965年發(fā)現(xiàn)的新種[1]。在廣西博白、玉林和陸川一帶，海拔 500 m以下有天然林存在多生于富含腐殖質(zhì)的酸性紅壤和黃紅壤的山腰、山谷、路旁和林中。天然林分布區(qū)多屬高溫高濕的南亞熱帶氣侯，最低月平均氣溫8～13 ℃，極端最低氣溫可達-5 ℃，年降水量為1 500～2 200 mm。博白大果油茶樹形優(yōu)美，花大果大，其種子含油豐富，是重要的觀賞植物[2]和油料植物[3-5]。其材質(zhì)堅硬而重，耐腐朽，最適做雕刻、日常生活用具、農(nóng)具等，茶油是醫(yī)藥上、工業(yè)上的原材料，具有重要的經(jīng)濟價值[6-7]。因森林資源不斷遭到砍伐和破壞，博白大果油茶野生資源數(shù)量稀少，在《中國植物紅皮書》中已將其定為漸危種，現(xiàn)被列為國家二級保護植物。目前對博白大果油茶的研究多集中在栽培、生長規(guī)律、核型分析等方面，從分子水平對其瀕危原因還沒有分析。

ISSR分子標記是在微衛(wèi)星分子標記技術的基礎上發(fā)展起來的一種新型分子標記技術，具有操作簡單，檢測靈敏，重復性好，檢測快速等優(yōu)點，已廣泛用于親緣關系鑒定、品種鑒定、遺傳圖譜構建，群體遺傳多樣性分析等多個方面。本研究采用ISSR分子標記技術首次對博白大果油茶天然種群和人工種群進行遺傳多樣性分析，揭示其遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構，探討人工種群和天然種群之間的基因差異，為博白大果油茶的引種狀況做出評價，為博白大果油茶資源保護、群體恢復和有效利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 樣品材料

本實驗樣品分別采自于廣西省博白縣那林鎮(zhèn)12個樣品、廣西省博白縣江寧鎮(zhèn)11個樣品、湖南省新寧縣林業(yè)科學研究所11個樣品及湖南省植物園8個樣品，全部為博白大果油茶優(yōu)樹或優(yōu)樹繁殖的實生苗。為了防止采到同一母樹的后代，采樣過程中保證兩個單株間的距離不少于50 m。采同一株的5～10 g新鮮嫩葉用濕紗布擦干凈后放到自封袋中，加入50～100 g干燥的硅膠，保證硅膠的質(zhì)量為新鮮葉子的10倍，搖動袋子使硅膠與葉子充分接觸，低溫保存，帶回實驗室，置于-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 不同種源博白大果油茶地理位置及主要氣象因子Table 1 Geographical locations and main meteorological factors of different provenances of C. gigantocarpa

1.2 引物材料

實驗所用ISSR引物是根據(jù)加拿大哥倫比亞大學公布的第9套ISSR引物序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，共100條引物。

1.3 總基因組DNA的提取及檢測

博白大果油茶總基因組DNA的提取采用天根生物生化有限公司提供的植物基因組DNA提取試劑盒進行提取，操作步驟按照說明書進行并作適當調(diào)整。用1%的瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白測定儀進行檢測。

1.4 引物篩選及退火溫度確定

利用ISSR最佳反應體系和擴增程序，根據(jù)引物序列的Tm值，在Tm-5℃到Tm+5℃范圍內(nèi)，對每條引物進行引物篩選和退火溫度確定，選取10條擴增條帶清晰、重復性好、多態(tài)性高的引物，用于博白大果油茶的ISSR-PCR擴增。

1.5 ISSR-PCR擴增和電泳檢測

利用最佳的ISSR-PCR反應體系、擴增程序[8]和篩選出的10條引物對所有的博白大果油茶DNA樣品進行PCR擴增。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，凝膠成像系統(tǒng)拍照，得到所有DNA樣品的擴增圖像。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，基于以下原則：同一引物的擴增產(chǎn)物中，電泳遷移率一致的條帶認為是同一條帶；電泳遷移率相同，但條帶強度不同，當強帶超過弱帶的兩倍時，視為新帶；根據(jù)Hardy-Weinberg平衡理論，剔除基因頻率小于3/N（N為樣本數(shù)，本研究中N為42）的條帶[9]；條帶模糊不清不統(tǒng)計。

利用200 bpDNA ladder marker進行對比，確定每條引物擴增片段的大小，并將其進行排序。根據(jù)電泳圖中擴增的條帶有無情況進行賦值，有條帶出現(xiàn)的賦值為“1”，無條帶出現(xiàn)的賦值為“0”，得到博白大果油茶的0/1數(shù)據(jù)矩陣。利用PopGen32 軟件分析博白大果油茶種群多態(tài)性位點百分比（PPB）、Nei’s基因多樣性（H）、Shannon信息多樣性指數(shù)（I）、種群內(nèi)基因多樣性（Hs）、種群總基因多樣性（Ht）、種群間遺傳分化指數(shù)（Gst）和基因流（Nm）。并根據(jù)Nei’s遺傳一致度和遺傳距離，確定各種群間的親緣關系。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性

利用已經(jīng)優(yōu)化的ISSR-PCR擴增體系及篩選出的10條ISSR引物對4個種群的42份博白大果油茶DNA樣品進行ISSR-PCR擴增，10個引物對42份實驗材料均能很好的擴增，ISSR-PCR擴增的DNA片段大小一般在220～2 000 bp之間，共檢測到115條清晰可重復的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶為98條，總多態(tài)位點百分率為85.22%。每個引物可擴增的多態(tài)性條帶數(shù)目不等，在7～13條之間，多態(tài)性最高的為100%，最低的為77.78%，見（見表2）。

表2 ISSR引物擴增的位點Table 2 Amplification sites of ISSR primers

圖1 引物UBC825對博白大果油茶的多態(tài)性擴增Fig. 1 Polymorphism PCR of C. gigantocarpa in primer UBC825 (M: 200 bp DNA Ladder)

圖2 引物UBC840對博白大果油茶的多態(tài)性擴增Fig 2 Polymorphism PCR of C. gigantocarpa in primer UBC840 (M: 5 000 bp DNA marker)

2.2 博白大果油茶種群的多態(tài)性分析

4個種源地博白大果油茶多態(tài)位點百分率在51.30%～66.09%之間，而廣西省江寧鎮(zhèn)博白大果油茶種群多態(tài)位點百分率最高，說明這個種群的多態(tài)性最豐富，種群內(nèi)部基因交流比較頻繁，適應環(huán)境的能力最強，說明該種群更適合作為引種繁殖目標，有利于博白大果油茶種質(zhì)資源的保護及利用。

表3 4個種源的博白大果油茶的多態(tài)位點百分率Table 3 Proportion of polymorphic bands of 4 provenances of C. gigantocarpa

2.3 博白大果油茶ISSR遺傳多樣性分析

利用PopGen32軟件分析表明，42個博白大果油茶樣品的總的觀察等位基因數(shù)為1.852 2，總的有效等位基因數(shù)為1.563 7，總的Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.323 0，總的Shannon信息指數(shù)為0.476 6。就各種群而言，博白大果油茶4個居群Na的變異幅度為1.469 6～1.660 9，Ne變異幅度為1.365 5～1.470 2，H的變異幅度為0.199 9～0.264 7，I的變異幅度為0.287 7～0.386 1，說明不僅在種水平具有較高的遺傳多樣性，而且各個種群間也具有豐富的遺傳多樣性。

表4 4個種源的博白大果油茶的遺傳多樣性指標Table 4 Genetic polymorphism indexes of 4 provenances of C. gigantocarpa

2.4 博白大果油茶種群遺傳變異的分析

4個博白大果油茶種水平的基因多樣性（Ht）為0.323 3，其中群體內(nèi)基因多樣性（Hs）為0.228 0，種群間的基因多樣性（Dst）為0.095 3，種群內(nèi)遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.294 9，其種群內(nèi)變異為70.51%，說明博白大果油茶的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，地理環(huán)境對博白大果油茶種群間的遺傳分化影響也較大。種群間基因流（Nm）為1.195 4，大于1，證明居群間存在一定的基因流動，足以抵制遺傳漂變的作用。

2.5 遺傳一致度與親緣關系的聚類分析

如表5所示，博白大果油茶4個種群間的Nei’s遺傳距離范圍在0.111 4～0.215 4之間，湖南新寧與湖南植物園2個種群之間的遺傳距離最小，而廣西那林與湖南植物園之間的遺傳距離最大（為0.215 4），表明它們之間的遺傳差異較大；4個種群的遺傳一致度范圍在0.806 2～0.894 6之間，與遺傳距離的結(jié)果相一致，廣西那林與湖南植物園的遺傳一致度最小。每個種群的遺傳距離差異不大，說明各種群間的遺傳變異保持了相對較高的穩(wěn)定性。

表5 不同地理種源博白大果油茶的Nei’s(1978)遺傳距離和遺傳一致度?Table 5 Nei’s(1978) genetic distance and genetic identity among C. gigantocarpa of different provenances

對博白大果油茶4個種群進行UPGMA聚類分析（如圖3）表明，湖南新寧與湖南省植物園聚為一類，它們的親緣關系最近，廣西省博白縣那林鎮(zhèn)與廣西省博白縣江寧鎮(zhèn)聚為一類，湖南的兩個種群與廣西省博白縣兩個種群聚為一類它們之間的遺傳一致度差異僅為0.011，說明他們具有很近的親緣關系。

圖3 不同種源博白大果油茶Nei’s遺傳一致度的UPGMA聚類Fig.3 UPGMA clustering on Nei’s genetic consistent degrees among C. gigantocarpa of different provenances

3 討 論

遺傳多樣性是生命系統(tǒng)的基本特性，是物種適應環(huán)境和發(fā)生進化的遺傳基礎。在長期的自然演變過程中，由于受生態(tài)環(huán)境、氣候條件、栽培措施以及自然雜交等各種因素的影響，基因組DNA發(fā)生改變，產(chǎn)生遺傳變異。博白大果油茶多態(tài)位點百分比為85.22%。比廣布型植物如木荷[10]的遺傳位點百分比要低，比殼菜果[11]、資源冷杉等[12-14]的遺傳位點百分比要高，這與博白大果油茶的生境、授粉方式和種子萌發(fā)能力有很大的關系。

博白大果油茶種群間基因流（Nm）僅為1.195 4，存在一定的基因流動，可以抵制遺傳漂變的作用，但是各個種群間的基因交流還不夠豐富，這與博白大果油茶面積減少有很大關系；種群間遺傳分化系數(shù)（Gst）為0.294 9，其種群內(nèi)變異為70.51%，種群間的變異為29.49%，盡管種群內(nèi)變異占主導地位，但種群間變異遠遠高于廣布型植物，各種群間基因交流較少，地理環(huán)境對博白大果油茶種群間的遺傳分化影響較大。

從天然種群和栽培種群來看，博白大果油茶栽培種群的遺傳多樣性明顯低于天然種群，可能有以下三方面原因：一是種群大小，一般來講，種群中個體越多，遺傳多樣性越豐富；二是引種栽培時，不要只采摘一棵植株的種子，應該采集多棵，并且采集的植株應該在其分布區(qū)均勻分布；三是博白大果油茶從廣西引種至湖南，氣候條件的差異導致其遺傳多樣性降低，但目前博白大果油茶已能夠在湖南生長、自然更新，這也與最近一段時間氣候變暖有很大關系，尤其與冬季最低溫明顯升高有關。博白大果油茶種群的遺傳距離和遺傳一致度顯示，栽培種群和廣西江寧種群的遺傳一致度更近，因此，湖南新寧的博白大果油茶種群更有可能引致廣西江寧。

同時從聚類圖也可知湖南的博白大果油茶人工林與種源地存在一定的遺傳距離，表明博白大果油茶發(fā)生了適應當?shù)丨h(huán)境的遺傳變異，也進一步說明博白大果油茶引種到湖南是可行的。隨著全球氣候變化，溫度升高，本來分布于南亞熱帶地區(qū)（北緯22°08′）的博白大果油茶在湖南地區(qū)（北緯26°25′）經(jīng)過近30年的生長，也能適應當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境，產(chǎn)生相應的遺傳分化茁壯生長。

通過對博白大果油茶種群遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)，其種群具有較高的遺傳多樣性，具有較高的適應能力，但目前博白大果油茶種群在急劇減少，成為瀕危樹種，可能兩方面原因：一是當?shù)鼐用褚踩狈ΡＷo意識，人為因素干擾頻繁，成年的博白大果油茶由于被大量砍伐數(shù)量越來越少，幼苗數(shù)量也很少，只在保護區(qū)尚可見數(shù)量不多的博白大果油茶。另一原因是分布屏障，博白大果油茶天然林分布區(qū)植株很少且零星分布，阻隔了基因的交流，導致物種遺傳基礎的衰退，遺傳多樣性降低。因此，對博白大果油茶種群的保護需要加強宣傳教育，建立自然保護區(qū)，加大保護力度；利用現(xiàn)代生物技術對博白大果油茶進行進行人工繁殖；合理規(guī)劃，加大異地引種，擴大博白大果油茶人工林栽培面積，加強種群間的基因交流。

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Study on genetic diversity of Camellia gigantocarpa detected by ISSR markers

PENG Ji-qing, CAO Fu-xiang, FANG Hai-yan
(School of Life Science and Technology, Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China )

By using ISSR molecular marker techniques, the genetic diversity of 2 natural populations and 2 artif i cial populations of Camellia gigantocarpa were studied. The results show that the C. gigantocarpa populations’ genetic diversities were at higher levels，the main genetic variations of C. gigantocarpa populations came from the interior of populations，and the interpopulation differentiation degrees were at lower levels. The populations evolved along the common direction; the gene fl ow (Nm) among C. gigantocarpa was 1.195 4＞1.0, this is suff i cient to resist the effect the genetic drift. The UPGMA cluster analysis show that the artif i cial populations were introduced into Jiangning, Guangxi. Comparison with natural population, the artif i cial populations’ genetic diversity levels was slightly lower，but there was little difference. It showed that the artif i cial populations had adapted to the climatic characteristics of cultivation areas.

Camellia gigantocarpa; genetic diversity; ISSR

S718.46

A

1673-923X(2013)07-0062-05

2012-10-16

國家林業(yè)公益行業(yè)科研專項子項目(200804001)；中南林業(yè)科技大學校級重點學科建設項目(066)

彭繼慶(1986-),男,山東菏澤人,助教,主要從事生物化學與分子生物學方面研究；E-mail：pengjiqing17@126.com

曹福祥(1963-),男,湖南新化人,教授,主要從事生物化學與分子生物學研究；E-mail：csfucao@163.com

[本文編校：吳 毅]