毛雪琴，彭志榮，邱海萍，張 震，王艷麗，柴榮耀，姜 華，王教瑜，杜新法，孫國(guó)昌

(1.浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與微生物研究所，浙江杭州 310021;2.雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室湖南雜交水稻研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410125)

小麥赤霉病是禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)引起的麥類(lèi)常見(jiàn)的真菌性病害，發(fā)生廣泛，在我國(guó)流行很廣，特別是在雨量充足的長(zhǎng)江中下游地區(qū)，造成麥類(lèi)減產(chǎn)，品質(zhì)下降，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重［1-2］。1992-2001年，小麥赤霉病所造成的損失占總的麥類(lèi)病害損失的35.7%［3］，此外還產(chǎn)生毒素，對(duì)人體健康及家禽家畜產(chǎn)生毒害［4］。

現(xiàn)階段對(duì)于赤霉病的防治主要依賴(lài)化學(xué)農(nóng)藥，長(zhǎng)期使用造成農(nóng)藥殘留對(duì)人體的毒害，使植物產(chǎn)生抗藥性而防效降低，故開(kāi)發(fā)生產(chǎn)選擇性強(qiáng)、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性的生物農(nóng)藥勢(shì)在必行。目前用于防治赤霉病的生防制劑主要是芽孢桿菌(Bacillus spp.)和假單胞桿菌(Pseudomonas spp．)［5-7］等細(xì)菌類(lèi)產(chǎn)品。生防真菌能夠重寄生于病原菌并能夠長(zhǎng)期定殖于防治對(duì)象而使效果持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)［8］?，F(xiàn)階段能夠防治赤霉病的真菌性生物制劑很少，對(duì)赤霉病有效的真菌性生防菌株也鮮見(jiàn)報(bào)道。

MT-06是本試驗(yàn)室從草莓炭疽病標(biāo)樣上分離獲得的黃藍(lán)狀菌 (Talaromyces flavus)，前期試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株對(duì)大麥赤霉病菌等多種病原真菌具有較好的抑制作用［9］。本試驗(yàn)分析了MT-06發(fā)酵液的最適培養(yǎng)條件及其對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲和分生孢子的抑制作用，探討了抑菌活性物質(zhì)的萃取方法及粗提物的抑菌活性，并進(jìn)行了MT-06與化學(xué)殺菌劑甲霜錳鋅混配防治小麥赤霉病的田間小區(qū)試驗(yàn)，為生防菌MT-06的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株及藥劑

黃藍(lán)狀菌MT-06及禾谷鐮刀菌FG-10均為本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存;化學(xué)殺菌劑甲霜錳鋅可濕性粉劑 (代森錳鋅64%，甲霜靈8%)由利民化工有限公司生產(chǎn);化學(xué)藥劑石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均由杭州雙林化工生產(chǎn)。

1.2 發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用

1.2.1 發(fā)酵液的制備

將MT-06活化至PDA平板上，培養(yǎng)7 d后，打取5塊直徑為7 mm的菌餅，置于PDB(馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)基上，于28℃、150 r·min-1培養(yǎng)3 d。取孢子濃度1×106個(gè)·mL-1的發(fā)酵液，按5%接種量接種于裝有300 mL滅菌PDB的1 L三角瓶中，置于28℃、150 r·min-1搖床培養(yǎng)，12 d后，將培養(yǎng)液用濾紙濾去菌絲后，4℃下12 000 r·min-1離心30 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后4℃避光冷藏備用。

1.2.2 發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響

平板抑制試驗(yàn)。將滅菌后的PDA自然冷卻至60℃左右，在9 cm平板中加入18 mL PDA+2 mL發(fā)酵液，對(duì)照組為18 mL PDA+2 mL無(wú)菌水，待平板凝固后，用打孔器打取7 mm活化培養(yǎng)3 d后的禾谷鐮刀菌菌餅，置于平板中央，28℃避光培養(yǎng)4 d，十字交叉量取記錄菌落直徑，并取平均值。每處理重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

抑菌率/%=(對(duì)照平均直徑-處理平均直徑)/(對(duì)照平均直徑-菌塊直徑) ×100。

凹玻片抑制試驗(yàn)。挑取少量PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d后的禾谷鐮刀菌菌絲于分別裝有200 μL無(wú)菌水和MT-06發(fā)酵液的凹玻片中，28℃避光保濕培養(yǎng)48 h。目測(cè)菌絲生長(zhǎng)情況，于顯微鏡100倍下觀(guān)察拍照。每處理重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.3 發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響

平板抑制試驗(yàn)。禾谷鐮刀菌孢子懸液通過(guò)0.45 μm孔徑濾膜除去菌絲，調(diào)整孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1備用。將 100 μL 孢子液 +100 μL MT-06發(fā)酵液加入PDA平板上的牛津杯中，加入100 μL孢子液+100 μL無(wú)菌水為對(duì)照，28℃避光培養(yǎng)48 h，觀(guān)察孢子萌發(fā)情況。每處理重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

凹玻片抑制試驗(yàn)。在試驗(yàn)組中加入100 μL禾谷鐮刀菌分生孢子液+100 μL MT-06發(fā)酵液，對(duì)照組中加入100 μL禾谷鐮刀菌分生孢子液 +100 μL無(wú)菌水，28℃避光培養(yǎng)48 h，觀(guān)察孢子萌發(fā)情況。每處理重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3 發(fā)酵液最佳培養(yǎng)時(shí)間測(cè)定

發(fā)酵液制備同1.2.1節(jié)。每24 h收集1次，連續(xù)收集30 d。以禾谷鐮刀菌為靶標(biāo)菌，進(jìn)行不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定，方法同1.2.2節(jié)。每處理重復(fù)3次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.4 發(fā)酵液萃取方法及活性物質(zhì)抑菌測(cè)定

將MT-06發(fā)酵液分別用石油醚、乙酸乙酯及正丁醇等體積萃取3次，合并有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸干，得粗提物;按500 μg·mL-1的濃度用萃取劑溶解粗提物，以禾谷鐮刀菌為靶標(biāo)，設(shè)置粗提物濃度分別為20，40，60，80，100 μg·mL-1，以 100 μg·mL-1百菌清為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，方法同1.2.2節(jié)。

1.5 田間小區(qū)試驗(yàn)

1.5.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及品種

在浙江省寧?？h越溪鄉(xiāng)灰場(chǎng)村進(jìn)行，供試小麥品種為揚(yáng)麥12號(hào)，播種方式為撒播。小麥赤霉病為田間自然發(fā)病，其他按常規(guī)栽培管理。

1.5.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共設(shè)7個(gè)處理:①4 mg·mL-1甲霜錳鋅;②1×106個(gè)·mL-1MT-06孢子液+2 mg·mL-1甲霜錳鋅;③1×106個(gè)·mL-1MT-06孢子液;④MT-06發(fā)酵液;⑤稀釋5倍的 MT-06發(fā)酵液;⑥稀釋10倍的MT-06發(fā)酵液;⑦清水對(duì)照。每處理設(shè)3小區(qū)，每小區(qū)40 m2，隨機(jī)區(qū)組排列。其中MT-06孢子液的制備方法為MT-06孢子懸液通過(guò)0.45 μm孔徑濾膜除去菌絲，調(diào)整孢子濃度為1×106個(gè)·mL-1后備用。待小麥完全抽穗后按750 kg·hm-2噴霧量使用山東衛(wèi)士WS-16P噴霧器進(jìn)行均勻噴灑。20 d后進(jìn)行病情調(diào)查，調(diào)查方法、病情指數(shù)及防治效果計(jì)算參照GB/T 15796—1995。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)分析參見(jiàn)唐啟義等編著的第2版DPS軟件［10］，通過(guò)Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

平板抑制試驗(yàn)結(jié)果如圖1中A所示。培養(yǎng)4 d的結(jié)果顯示，稀釋10倍后的MT-06發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌絲生長(zhǎng)抑制率為40.1%，表明MT-06發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制作用。凹玻片抑制試驗(yàn)?zāi)繙y(cè)觀(guān)察如圖1中B所示。

置于MT-06發(fā)酵液和無(wú)菌水凹玻片中的禾谷鐮刀菌絲于28℃下保濕培養(yǎng)48 h后，對(duì)照組中禾谷鐮刀菌絲團(tuán)增大變紅，試驗(yàn)組基本無(wú)變化。鏡檢顯示，對(duì)照組產(chǎn)生了大量分生孢子 (圖1中C)，而試驗(yàn)組則基本沒(méi)有產(chǎn)生分生孢子 (圖1中D)。表明發(fā)酵液對(duì)禾谷鐮刀菌絲產(chǎn)孢具有強(qiáng)烈的抑制作用。

2.2 發(fā)酵液對(duì)鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響

平板抑制試驗(yàn)表明，與等量MT-06發(fā)酵液混合后，禾谷鐮刀菌分生孢子不能萌發(fā)，抑制率達(dá)100%(圖2中B)。凹玻片抑制試驗(yàn)鏡檢顯示，與等量MT-06發(fā)酵液混合的禾谷鐮刀菌分生孢子胞壁和隔膜變厚，兩頭變鈍，不能正常萌發(fā) (圖2中D)，與水混合的禾谷鐮刀菌分生孢子能正常萌發(fā)伸長(zhǎng)產(chǎn)生菌絲 (圖2中E)。表明MT-06對(duì)禾谷鐮刀菌分生孢子的萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用。

圖2 發(fā)酵液對(duì)鐮刀菌分生孢子萌發(fā)的影響

2.3 發(fā)酵液的最佳培養(yǎng)時(shí)間

通過(guò)30 d的取樣，將不同培養(yǎng)時(shí)間的MT-06發(fā)酵液稀釋10倍后，對(duì)禾谷鐮刀菌的抑菌活性測(cè)定結(jié)果表明，在PDB培養(yǎng)基中，28℃、150 r·min-1條件下，培養(yǎng)初期隨著時(shí)間的增加，MT-06發(fā)酵液抑菌活性越來(lái)越強(qiáng)，在第14天達(dá)到高峰，平板抑菌效果達(dá)到最高，為42.2%。隨著培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)增加，發(fā)酵液抑菌活性逐漸降低，第30天下降為18.7%。表明有效抑菌物質(zhì)在后期產(chǎn)量下降較快，并有一定降解，但仍具有部分抑菌活性，其中可能有部分抑菌活性物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定。綜上可知，在既定條件下，MT-06的最佳發(fā)酵時(shí)間為14 d(圖3)。

2.4 萃取方法及活性物質(zhì)抑菌測(cè)定

圖3 發(fā)酵液在不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)鐮刀菌絲生長(zhǎng)的抑制

通過(guò)不同萃取劑萃取后的抑菌測(cè)定發(fā)現(xiàn)，正丁醇和石油醚萃取物抑菌效果不明顯，而乙酸乙酯萃取物抑菌活性較強(qiáng)。稀釋10倍后抑菌率達(dá)到44.91%，由此確定萃取劑為乙酸乙酯 (圖4)。

圖4 乙酸乙酯萃取液對(duì)小麥赤霉病菌絲生長(zhǎng)的影響

隨后通過(guò)乙酸乙酯大量萃取MT-06發(fā)酵液，進(jìn)行活性粗提物抑菌測(cè)定 (表1)。

表1 乙酸乙酯粗提物對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用

以禾谷鐮刀菌為靶標(biāo)，設(shè)置粗提物濃度分別為20，40，60，80，100 μg·mL-1，對(duì)照組為 100 μg·mL-1的百菌清。結(jié)果表明，隨著萃取物濃度提高，抑菌效果增強(qiáng);當(dāng)萃取物濃度為80 μg·mL-1時(shí)，抑菌活性與百菌清相當(dāng);當(dāng)濃度提高到100 μg·mL-1時(shí)，抑菌效果顯著高于百菌清，達(dá)到71.80%。

2.5 田間小區(qū)試驗(yàn)

田間試驗(yàn)結(jié)果 (表2)表明，試驗(yàn)各處理的病情指數(shù)均低于清水對(duì)照，其中防效最好的是處理②，及陽(yáng)性對(duì)照處理①，防效分別達(dá)到72.62%和71.78%，高于其他4個(gè)處理，顯示極顯著差異。防效較好的還有處理④，為61.0%，高于處理③(31.49%)、⑤ (35.26%)和⑥ (23.17%)的防效，差異極顯著。綜上表明，發(fā)酵液在濃度較高時(shí)，對(duì)小麥赤霉病有較好防效，但隨著發(fā)酵液濃度降低，防效迅速下降。MT-06孢子液中加入2 mg·mL-1甲霜錳鋅后，防效極顯著地高于MT-06孢子液的處理，達(dá)到甚至超過(guò)了陽(yáng)性對(duì)照4 mg·mL-1甲霜錳鋅的處理，但差異不顯著。表明菌藥混配可在不影響防效的情況下減少農(nóng)藥的使用量。

表2 MT-06及菌藥混配對(duì)小麥赤霉病防治效果

3 小結(jié)和討論

在確定MT-06對(duì)禾谷鐮刀菌具有抑制作用的基礎(chǔ)上，研究了MT-06的發(fā)酵條件，表明在PDB液體培養(yǎng)基中，5%接種量，28℃，150 r·min-1條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，發(fā)酵液的抑菌效果增強(qiáng)，到第14天時(shí)達(dá)到峰值。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵液的抑菌效果逐步減弱，到第28天后，抑制率曲線(xiàn)趨于平緩。由此推測(cè)，MT-06的發(fā)酵產(chǎn)物中，具有抑菌活性的組分不止一種，既有易于降解的活性組分，也有性質(zhì)較穩(wěn)定的組分。本文初步探明了MT-06發(fā)酵液的萃取方法，獲得了具有抑菌活性的粗提物，有關(guān)活性物質(zhì)的成分分析及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

由于單獨(dú)使用生防菌存在效果不穩(wěn)定和療效慢等缺點(diǎn)，采用化學(xué)農(nóng)藥與生防菌混配防治病害，具有一定的可行性［11］。化學(xué)農(nóng)藥可弱化病原菌，從而有利于生防菌對(duì)于病原菌的侵入與抑制［12］。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期的室內(nèi)生測(cè)試驗(yàn)，篩選出了甲霜錳鋅對(duì)小麥赤霉病菌具有強(qiáng)烈抑制作用，而對(duì)生防菌MT-06的影響相對(duì)較小。故開(kāi)展了甲霜錳鋅與生防菌MT-06混配防治小麥赤霉病的田間小區(qū)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，生防菌孢子液中加入一定量的化學(xué)殺菌劑后，大幅增強(qiáng)了防治效果。1996年 Kantan［13］提出用農(nóng)藥弱化病原菌的方法提高生防效果。經(jīng)過(guò)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)植物致病菌的弱化，生防菌定植于病原菌的能力增強(qiáng)，使得生防菌在與病原菌的對(duì)抗中占優(yōu)勢(shì)，并長(zhǎng)期發(fā)揮作用。本文的研究結(jié)果與該報(bào)道一致，但其弱化的作用機(jī)制還有待研究。小區(qū)試驗(yàn)還表明，MT-06與農(nóng)藥混配，可在保證相同防效的基礎(chǔ)上，降低農(nóng)藥的使用量，這為生防菌的開(kāi)發(fā)利用提供了更多的思路。MT-06發(fā)酵液的田間使用對(duì)小麥赤霉病也有較好防效，但高效的發(fā)酵工藝及與化學(xué)殺菌劑的混配使用等問(wèn)題還有待深入探討。

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