張鐵華 楊 濤 張永利 張春麗 劉太平 河北省玉田縣醫(yī)院眼科（玉田064100）

缺血再灌注可造成視網(wǎng)膜損傷，與其他組織的損傷機(jī)制相同，也是多因素綜合作用的結(jié)果，主要包括自由基的大量產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)的鈣超載現(xiàn)象，白細(xì)胞作用以及細(xì)胞凋亡等。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測視網(wǎng)膜丙二醛（MDA）含量以及Ca2＋含量，來研究丹參注射液對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并探討其保護(hù)作用機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料 48只健康純種大耳白兔（購于北京實(shí)驗(yàn)動物中心），體重3.0±0.2kg，雄性，外眼及眼底檢查均正常，室溫環(huán)境飼養(yǎng)。隨機(jī)分為對照組：球后注射平衡鹽溶液（48只左眼）和治療組：球后注射丹參注射液（48 只右眼）。30min后制作缺血模型，維持缺血60min，分別于再灌注1h、6h、24h、72h進(jìn)行MDA 和Ca2＋含量檢測。

1.2 方法 1.2.1兔視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷模型的制作以20%烏拉坦5mL／kg耳緣靜脈注射麻醉，同時兔眼滴用0.4%倍諾喜（奧布卡因）行表面麻醉。于缺血再灌注損傷前30min左眼球后注射平衡鹽溶液0.05mL，右眼球后注射丹參注射液0.05mL。球后注射半小時后開始建立模型，復(fù)方托品酰胺滴眼液散瞳后將連接生理鹽水的5號頭皮針從耳前方角鞏膜緣內(nèi)刺入前房，緩慢升高輸液瓶高度產(chǎn)生16.7kP 壓力（125.25mmHg 即170.30cm 水柱），觀察并監(jiān)測眼睛情況。60min后將輸液瓶高度逐漸降低，緩慢減低眼內(nèi)壓，直至輸液瓶高度到動物眼球水平，拔除灌注針頭，視網(wǎng)膜血供恢復(fù)。

1.2.2 標(biāo)本制作 根據(jù)各組不同的再灌注時間，分別于損傷后lh、6h、24h和72h全身麻醉后，耳緣靜脈快速注入空氣栓塞處死，取出眼球，至于冰生理鹽水中，剪開角鞏膜緣，棄去眼前節(jié)及玻璃體，外翻眼球壁，在顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，分析天平稱重，用生理鹽水稀釋，勻漿，低溫離心機(jī)3500r／min 離心10min，取上清液，硫代巴比妥酸法測量丙二醛（MDA）含量，分光光度計法測定鈣含量。

2 結(jié)果

2.1 MDA 含量檢測 見表1。

表1 兩組傷后不同時間MDA 含量（±s）

表1 兩組傷后不同時間MDA 含量（±s）

△同一時間點(diǎn)對照組與治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

傷后時間組 別1h6h24h72h對照組4.15±0.15 4.32±0.16 6.19±0.21 6.73±0.23治療組3.78±0.15△ 3.93±0.26△ 5.25±0.15△ 5.52±0.14△

2.2 鈣含量檢測 見表2。

表2 兩組傷后不同時鈣含量（±s）

表2 兩組傷后不同時鈣含量（±s）

△除缺血再灌注后1h外（P＞0.05），同一時間點(diǎn)對照組與治療組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

傷后時間組 別1h6h24h72h對照組0.121±0.005 0.181±0.173 0.496±0.413 0.349±0.207治療組0.115±0.0130.140±0.170△0.407±0.368△0.299±0.202△

3 討 論 視網(wǎng)膜缺血再灌注是由多種因素介導(dǎo)的復(fù)雜病理生理過程，而自由基連鎖反應(yīng)是造成組織損傷的核心環(huán)節(jié)。在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷過程中，抗氧化酶系統(tǒng)活性減弱，氧自由基及氧自由基類產(chǎn)物增加［1］。大量超氧化物陰離子自由基，與組織發(fā)生反應(yīng)，使盤膜、線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜內(nèi)的脂類受到不可逆損害，使生物膜的通透性、流動性和功能受損，并導(dǎo)致生物膜溶解，此外缺氧時氧可以還原為O2－自由基，使脂質(zhì)過氧反應(yīng)增強(qiáng)，丙二醛生成增多，加重視網(wǎng)膜損傷。

Ca2＋廣泛存在于身體的各種組織中，在體內(nèi)參與許多重要生理活動，也參與了許多病理過程。鈣超載是許多原因引起細(xì)胞損害的“最后共同通路”。視網(wǎng)膜是代謝非常旺盛的組織，其耗氧及糖原分解能力超過全身其它任何組織，因此對缺血、缺氧極其敏感。范定懷等［2］以大鼠視網(wǎng)膜為研究對象，觀察缺血再灌注對其細(xì)胞線粒體鈣含量的影響。各種實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在視網(wǎng)膜缺血再灌注過程中，缺血數(shù)分鐘就會引起視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量開始升高。再灌注開始幾分鐘大量鈣離子進(jìn)入視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)，說明鈣超載主要是發(fā)生在再灌注期。RIRI致使在興奮性氨基酸毒性的作用鈣離子大量內(nèi)流導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷。

丹參具有抑制細(xì)胞凋亡、抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基、鈣拮抗劑作用，此外丹參還具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等作用。丹參是一種強(qiáng)抗氧化劑，經(jīng)臨床應(yīng)用使血清SOD 上升、MDA 下降。丹參的保護(hù)作用可能是打破氧自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損害、發(fā)病機(jī)制的惡性循環(huán)，抑制脂質(zhì)過氧化物的形成，抑制自由基介導(dǎo)的細(xì)胞損害作用，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性［3］。丹參作為一種鈣拮抗劑，可通過降低膜通透性、阻斷細(xì)胞膜鈣通道、阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣庫鈣釋放通道等途徑減輕鈣超載。Oh－Ju等［4］應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷后鈣結(jié)合蛋白－28的變化與視網(wǎng)膜缺血再灌注的時間密切相關(guān)。Bringmann等發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)的谷氨酸受體引起的Ca2＋內(nèi)流可觸發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡。這也充分證實(shí)鈣離子在視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷中的作用。從本實(shí)驗(yàn)中可以得出：丹參注射液可以通過清除自由基、減輕鈣超載，而起到對視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷的保護(hù)與治療作用。

［1］ Song Y，Gong YY，Xie ZG，Li CH，Gu Q Wu XW.Edaravone（MCI－186），a free radical scavenger，attenuates retinal ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Acta Pham a col Sin，2008，29（7）：823－828.

［2］ 范定懷，陳少強(qiáng)，黃 炎，等.缺血再灌注大鼠視網(wǎng)膜微血管基膜細(xì)胞外基質(zhì)與視網(wǎng)膜線粒體鈣含量的變化［J］.中國臨床康復(fù)，2005，9（30）：144－146.

［3］ 周昆寶.大劑量丹參黃茂治療新生兒缺氧缺血性腦病的療效觀察［J］.江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，44（1）：78－79.

［4］ Kwon OJ，Kim JY，Kim SY，et al.Alterations in the localization of calbindin D28K－，calretinin－，and parvalbuminimmuno－reactive neurons of rabbit retinal ganglion cell layer from ischemia and reperfusion［J］.Mol Cells，2005，19，（3）：382－390.