楊 靜 萬峰峰 蔡慧俠 楊飛快 西安金花制藥廠（西安710065）

血復(fù)生膠囊為中藥復(fù)方制劑，是由黃芪、白芍、女貞子、當(dāng)歸、川芎、大黃、山藥、茯苓等16味藥材加工制備而成。具有益氣養(yǎng)陰血、滋陰涼血、化瘀解毒的功效。用于氣血兩虛、陰虛津虧、止汗盜汗、煩躁失眠、出血紫斑等惡性貧血，癌癥放化療后的血象異常，尤其對白細(xì)胞減少癥有明顯的升高或調(diào)整血象的作用。白細(xì)胞減少癥從中醫(yī)辨證乃屬“眩暈”、”虛勞”。黃芪、當(dāng)歸、女貞子等均有升白作用。為了有效地控制藥品質(zhì)量，本實驗采用薄層色譜（TLC）法對制劑中的女貞子、黃芪、當(dāng)歸、川芎、大黃進(jìn)行定性鑒別，采用顯微鑒別法對山藥、茯苓顯微鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對白芍中的芍藥苷進(jìn)行含量測定［1］，獲得滿意效果?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 P608 HPLC Pμmp，μVD17μ 檢測器，Chromeleon工作站，自動進(jìn)樣器（美國戴安公司），AL204－IC 型電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）、BP211D 型電子天平（梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司）。

1.2 試藥 芍藥苷對照品（批110736－201023，供含量測定用）、女貞子對照藥材（批號：1041－201001，供鑒別用）、黃芪對照藥材（批號：120974－201006，供鑒別用）、當(dāng)歸對照藥材（批號：9271－200910，供鑒別用）、川芎對照藥材（批號：120918－200906，供鑒別用）、大黃酚對照品（批號分別為796－200904，供含量測定用）均購自中國藥品生物制品檢定所；血復(fù)生膠囊，購自黑龍江省完達(dá)山制藥廠；硅膠G 購自青島海洋化工廠；試劑：乙腈為色譜純，水為重蒸水，其它試劑均為分析純（西安化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取本品內(nèi)容物置顯微鏡下觀察：淀粉粒三角狀卵形或距圓形，直徑24～40μm，臍點(diǎn)短縫狀或人字狀。不規(guī)則分枝狀團(tuán)塊無色，遇水合氯醛液溶化；菌絲無色或淡棕色，直徑4～6μm。

2.2 薄層色譜鑒別

2.2.1女貞子的薄層鑒別 取本品15粒內(nèi)容物，研細(xì)，加三氯甲烷60mL，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷1mL使溶解，作為供試品溶液。取血復(fù)生膠囊去女貞子的陰性樣品15粒，同法制成去女貞子的陰性樣品溶液。另取女貞子對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述三種溶液各10～15μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－丙酮（5∶2∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.2.2 黃芪的薄層鑒別 取本品20粒內(nèi)容物，研細(xì)，加乙醇30mL，加熱回流30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加0.3%氫氧化鈉溶液15mL使溶解，濾過，濾液用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至5～6，用乙酸乙酯15mL 提取，分取乙酸乙酯液，用鋪有適量無水硫酸鈉的濾紙濾過，濾液蒸干。殘渣加乙酸乙酯1mL 使溶解，作為供試品溶液。取血復(fù)生膠囊去黃芪的陰性樣品15粒，同法制成去黃芪的陰性樣品溶液。另取黃芪對照藥材，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述三種溶液各5～10μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇（10∶1）作為展開劑，展開，取出，晾干，置氨蒸氣中熏后置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.2.3 當(dāng)歸和川芎的薄層鑒別 取本品20粒的內(nèi)容物，研細(xì)，加乙醚100mL，加熱回流1h，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1mL使溶解，作為供試品溶液。取血復(fù)生膠囊去當(dāng)歸和川芎的陰性樣品20粒，同法制成去當(dāng)歸和川芎的陰性樣品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材和川芎對照藥材各1g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述四種溶液各10～15μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正己烷－乙酸乙酯（8∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈光（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.2.4 大黃的薄層鑒別 取本品20粒內(nèi)容物，研細(xì)，加甲醇30mL，超聲60min，濾過，取濾液10mL，蒸干，殘渣加水10mL使溶解，再加鹽酸1mL，水浴加熱30min，立即冷卻，用乙醚提取2次，每次20mL，合并乙醚液，蒸干，殘渣加三氯甲烷1mL使溶解，作為供試品溶液。取血復(fù)生膠囊去大黃的陰性樣品20粒，同法制成去大黃的陰性樣品溶液。另取大黃對照藥材0.1g，同法制成對照藥材溶液。再取大黃酚對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述四種溶液各5～10μl，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯－甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.3芍藥苷的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Lichrospher－C18（4.6×250mm，5μm）（江蘇漢邦科技有限公司）；流動相：乙腈－0.1%磷酸（15：85）；流速：1mL／min；柱溫：室溫；檢測波長：230nm。進(jìn)樣量：10μl［2］。在選定條件下，芍藥苷與其它組分色譜峰可達(dá)基線分離，且與相鄰色譜峰分離度大于1.5，且理論塔板數(shù)不小于2000。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36h的芍藥苷對照品適量，加甲醇制成每lmL 含50μg的溶液，取續(xù)濾液，作為對照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 取本品20 粒內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，取細(xì)粉約2.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。

2.3.4 陰性樣品溶液的制備 取除白芍外的其它處方量藥材，按制備工藝方法制備缺白芍的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺白芍的陰性樣品溶液。

2.3.5 測定及結(jié)果 分別精密上述對照品溶液、陰性樣品溶液與供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定。結(jié)果表明，色譜行為良好，各色譜峰均達(dá)基線分離，供試品色譜中，在與對照品色譜峰相應(yīng)的位置上檢出色譜峰，而缺白芍的陰性樣品溶液色譜中無色譜峰，說明陰性樣品無干擾。

2.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制： 取芍藥苷對照品溶液（76.2ug／mL），精密吸取1μl，3μl，5μl，10μl，20μl注入高效液相色譜儀中，按照上述色譜條件測定峰面積，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，平均峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算回歸方程為：Y＝22.29864X－0.36812，r＝0.9999，芍藥苷在0.0762～1.5240ug范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.7 精密度試驗 精密吸取樣品溶液10μl，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，測得芍藥苷峰面積計算RSD 為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8h 測定，進(jìn)樣量10μl。測得芍藥苷峰面積計算RSD 求得為0.25%。結(jié)果表明，供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗 取同一樣品批號（20040501）5份，分別按上述含量測定方法測定其芍藥苷含量，測得芍藥苷RSD為0.28%。結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性良好。

2.3.10 回收率試驗 采用加樣回收法，稱取已知含量的供試品（批號：20040501，含量：0.188mg／粒）9份，各精密加入黃芩芍藥苷對照品溶液（0.63mg／mL）1mL，按供試品制備方法和測定條件進(jìn)行測定，得芍藥苷平均回收率為99.42%，RSD＝0.3%。見表1。

表1 黃芩苷回收率實驗結(jié)果

2.3.11 樣品含量測定 按上述條件和方法測定3批樣品中芍藥苷含量，結(jié)果分別為0.188、0.191、0.175mg／粒，考慮到藥材的來源，以及生產(chǎn)、儲藏等因素，故暫定本品每粒中含芍藥苷（C23H28O11）計，不得少于0.15mg。

3 小結(jié)與討論

芍藥苷是該制劑中白芍的主要成分，采用HPLC法測定該制劑中芍藥苷的含量可作為此制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制指標(biāo)［4］。

在對供試品提取條件的確定過程中，曾比較了回流提取法、超聲提取法2種提取方法，并比較了甲醇、乙醇2種溶劑，結(jié)果表明，采用超聲提取法以甲醇做提取溶劑所制得供試品，雜質(zhì)含量少且待測成分含量高，故確定以甲醇為提取溶劑采用超聲提取法進(jìn)行樣品的提??；進(jìn)一步試驗比較了溶劑用量（10mL，20mL，30mL）、溶劑濃度（30%，50%，100%）及超聲時間（15min，30min，45min）。最終確定溶劑用量為20mL，溶劑濃度為50%，超聲時間為30min［3，4］。

試驗結(jié)果表明，本方法專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、精密度、回收率都較滿意，因此可作為血復(fù)生膠囊的質(zhì)量控制。

［1］ 國家藥典委員會.中國藥典［S］.一部.北京：化學(xué)工業(yè)出版社2010：1.

［2］ 劉素文，高明煥，郭艷霞.三白通絡(luò)膠囊質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.河北中醫(yī)，2008，30（02）：206－208.

［3］ 惠婷婷，夏忠庭，張?zhí)m蘭，等.HPLC測定郁舒顆粒芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的含量［J］.陜西中醫(yī)，2012，31（04）：480－481.

［4］ 李雪晴，王 超，文愛東.HPLC 法測定益胃顆粒中芍藥苷的含量［J］.陜西中醫(yī)，2010，29（06）：737－738.