楊 陽，楊 燕 ，王根緒，郭劍英，3，羊留冬

(1.中國科學(xué)院水利部成都山地災(zāi)害與環(huán)境研究所山地環(huán)境演變與調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041;2.中國科學(xué)院研究生院，北京 100049;3.樂山師范學(xué)院旅游與經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，樂山 614004)

以全球變暖為主要特征的全球氣候變化已經(jīng)改變并正在繼續(xù)改變著陸地生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，并間接威脅著人類的生存與健康，因而備受世界各國政府和科學(xué)家的普遍關(guān)注［1］。大量的監(jiān)測和模擬研究結(jié)果表明，20世紀(jì)開始的全球溫室效應(yīng)正在不斷的擴(kuò)大，地球表面平均溫度在過去的100a中已上升了0.6℃。政府間氣候變化專門委員會(IPCC)第4次評估報(bào)告預(yù)測到21世紀(jì)末，全球平均氣溫將升高1.8—4.0℃［2］。氣候變暖導(dǎo)致氣溫和土壤溫度升高，從而直接或間接地影響了植物的生長、生物量分配格局、氣孔密度甚至光合和蒸騰作用［3－6］，進(jìn)而引起群落結(jié)構(gòu)的強(qiáng)烈變化［4］。與此同時(shí)，植物體內(nèi)部生理特征也會對增溫產(chǎn)生響應(yīng)。對云杉幼苗的研究發(fā)現(xiàn)，增溫能引起丙二醛含量、過氧化氫濃度和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率降低，增加超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性［7］。也有研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，植物葉片中的可溶性糖含量和超氧化物歧化酶活性先增加后降低，而淀粉含量和谷胱甘肽酶活性先降低后增加［8］。這些研究大多是實(shí)驗(yàn)室或溫室控制條件下開展的模擬增溫試驗(yàn)，而在野外自然條件下構(gòu)建增溫對亞高山典型針葉林優(yōu)勢物種幼苗早期生長和生理影響的研究則較少［9］。

幼苗作為森林更新的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，是森林更新成功與否的關(guān)鍵。凋落物對森林更新早期階段具有重要意義，它通過各種直接或間接的作用影響著幼苗生長。直接的物理障礙增加幼苗的損傷和死亡［10］，間接地通過降解產(chǎn)生的營養(yǎng)物質(zhì)增加土壤肥力、減少凋落物覆蓋緩解非生物條件產(chǎn)生的脅迫，從而促進(jìn)幼苗生長，增加幼苗存活率［11－12］。這些研究大多集中在凋落物單獨(dú)效應(yīng)下植物的形態(tài)和理化特征的響應(yīng)，而忽略了氣候變暖背景下不同物種組成森林凋落物對幼苗早期生長的影響［13－14］。

峨眉冷杉林是青藏高原亞高山暗針葉林的重要組成部分，其森林更新的早期階段是關(guān)系到這一地區(qū)針葉林群落成功演替與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并對氣候變化十分敏感。近年來，有研究表明小于20a的峨眉冷杉林更新幼苗數(shù)量少，呈現(xiàn)中幼林比例下降等更新能力明顯衰退現(xiàn)象［15］，而該針葉林林下生長的密集灌叢，使林下凋落物蓋度大而厚，給森林更新帶來極大的困難，是限制森林早期更新的主要因素之一［16］。隨著近年來青藏高原氣候變暖趨勢的持續(xù)增強(qiáng)［17］，不僅凋落物的量和類型及其時(shí)空分布將受到顯著影響，而且凋落物的質(zhì)量和化學(xué)特性將發(fā)生明顯變化［18－19］。在這種情況下，一個亟需解決的關(guān)鍵科學(xué)問題是:氣溫升高及其驅(qū)動的凋落物的上述變化對森林更新早期階段的幼苗建成產(chǎn)生何種影響?針對這一問題，本研究通過模擬氣候變暖和不同類型凋落物的聯(lián)合作用，闡明亞高山典型針葉林峨眉冷杉早期更新對氣候變暖與凋落物變化聯(lián)合作用的響應(yīng)模式，并探索其內(nèi)在機(jī)制，以豐富山地生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對未來氣候變暖的全面認(rèn)識，并且為當(dāng)?shù)厣止芾砗捅Ｓ峁┛茖W(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)域概括

貢嘎山位于青藏高原東緣，橫斷山系中段，屬青藏高原與四川盆地過渡帶，地理位置介于101°30'—102°15'E和29°20'—30°20'N，主峰海拔7556 m。試驗(yàn)地設(shè)置在中國科學(xué)院貢嘎山高山生態(tài)系統(tǒng)觀測試驗(yàn)站附近(3000 m)，研究區(qū)域的年平均溫度3.8℃，平均降水量1940.0 mm，主要集中在6—8月。年均蒸散量1578.6 mm，相對空氣濕度90.2%。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

選擇貢嘎山高山生態(tài)系統(tǒng)觀測站附近峨眉冷杉林下微環(huán)境較一致的100 m×100 m樣地，利用開頂式氣室(OTCs)和加熱電纜聯(lián)合方法模擬氣候變暖，該OTCs為六邊形，8 mm厚的有機(jī)玻璃纖維制成的增溫小室，基面積為2.6 m2，頂部面積為1.27 m2，高度為0.52 m。功率為18 W/m，長為16 m，總功率為288 W的加熱電纜纏繞在直徑約為3.5 m、長度2.5 m的PVC管上，然后將其固定于OTC內(nèi)，固定位置離地面約15—20 cm，離OTC內(nèi)壁約10—20 cm。利用空氣和土壤溫濕度傳感器分別對框內(nèi)外的空氣溫度和濕度、土壤濕度進(jìn)行自動連續(xù)的檢測。與對照相比，空氣溫度平均增加約為2.9℃，土壤溫度平均增加1.8℃。取地表新鮮凋落物人工添加于各試驗(yàn)樣方內(nèi)，其厚度約為223 g/m2［20］。

本實(shí)驗(yàn)供試的材料來自于峨眉山苗圃(29°36'N，103°29'E，海拔3099 m)3年生峨眉冷杉幼苗，2009年5月上旬選擇健康一致的幼苗移栽于樣地內(nèi)。為了避免框邊邊緣效應(yīng)，OTCs增溫小室只選取中心1 m2樣方內(nèi)，且對照和處理樣方內(nèi)幼苗數(shù)保持一致以盡可能保證相同的移栽密度，株距均為25 cm，每個樣方內(nèi)共25株冷杉幼苗。對照和處理均設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)之間間隔3—5 m。

1.3 樣品處理與化學(xué)分析方法

2010年7月在每個試驗(yàn)小區(qū)里隨機(jī)取多株冷杉幼苗，用剪刀剪取當(dāng)年新生葉5—6 g左右，錫箔紙包裹并標(biāo)記處理編號，冷藏于－80℃液氮罐帶回實(shí)驗(yàn)室分析。每個生理指標(biāo)重復(fù)3次，一個星期內(nèi)完成測試工作。

1.3.1 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的測定(O－2)和過氧化氫(H2O2)的含量

超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率參考Ke等［21］的方法，取葉片0.2000 g，加入1.5 mL的50 mmol/L pH值7.8磷酸緩沖液(含有0.1 mmol/LEDTA;0.3%(g/mL)TritonX－10;4%(g/mL)聚乙烯比個(PVP))，研磨后以10500×g離心20 min。取1 mL上清液為提取液，依次加入0.5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH值7.8)，1 mL 1 mmol/L鹽酸羥胺，搖勻，于25℃中保溫1 h，然后再加入1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸和1 mL 7 mmol/La－萘胺混合，于25℃中保溫20 min，然后在可見光分光度計(jì)測定OD530。根據(jù)測得的OD530，查NO－2標(biāo)準(zhǔn)曲線，可求得產(chǎn)生速率。

參考Prochazkova等［22］的方法。準(zhǔn)確稱取0.2000 g冷杉新生葉于6 mL 5%三氯乙酸中研磨成勻漿。在10000×g室溫下離心10 min。取上清液1 mL加入0.1 mL 20%TiCl4的濃鹽酸液，再加入0.2 mL濃氨水，搖勻。在10000×g室溫下離心10 min。沉淀用3 mL 1 mmol/L硫酸充分溶解后，置紫外可見光分光光度計(jì)上測定415 nm吸光值。

1.3.2 丙二醛(malondialdehyde(MDA))含量和膜透性的測定(電導(dǎo)率的測定)

參考 Dhinsa 和 Matowe［23］的方法。

利用公式CMDA(nmol/L)={(A532－A600)－0.0571×(A450－A600)}/0.155計(jì)算MDA量(排除多糖干擾)，用每克干(鮮)重中MDA的量表示MDA的含量，單位μmol/L干(鮮)重或nmol/L干(鮮)重。

膜的穩(wěn)定性可以間接由電子的滲透量來計(jì)算［24］。準(zhǔn)確稱取0.2000 g冷杉新生葉，加入10 mL無離子水，在10℃下振蕩2—4 h。測電導(dǎo)率C1，然后將材料煮沸，冷卻到室溫在測電導(dǎo)率C2。計(jì)算膜相對透性的公式:電導(dǎo)率(%)=C1/C2×100。

1.3.3 碳水化合物和游離脯氨酸的測定

參考可溶性糖類用蒽酮法測定［25］，用蔗糖作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在可見光光度計(jì)讀取630 nm波長下的吸光值。同時(shí)提取可溶性糖后的殘?jiān)每扇苄蕴菧y定的方法來測定淀粉含量［25］。

游離脯氨酸含量的測定參考Bates等［26］的方法。準(zhǔn)確稱取0.2000 g冷杉新生葉，用5 mL 3%磺基水楊酸溶液研磨提取，勻漿以1000×g離心10 min。取上清液2 mL加入2 mL 3%磺基水楊酸，2 mL冰乙酸和4 mL 2.5%茚三酮，置于沸水浴中顯色分鐘。冷卻，加入3 mL甲苯。520 nm波長處的吸光值，以甲苯為空白。

1.3.4 抗氧化酶活性

準(zhǔn)確稱取0.2000 g冷杉新生葉放入預(yù)先冷卻的研缽里，加入6 mL的50 mmol/L磷酸緩沖液(內(nèi)含0.1 mmol/LEDTA，體積分?jǐn)?shù)0.3%TritonX－100，4%(g/mL)不溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP))中研磨成勻漿。以1000×g離心10 min。收集上清液用于SOD、APX、CAT、GR活性測定。

(1)超氧歧化酶(superoxide dismutase(SOD))活性的測定依照Becana等［27］等的方法，取上清液加入100 μL 加入3 mL 反應(yīng)液(內(nèi)含 50 mmol/L 甲硫氨酸(Met)、750 μmol/LNBT、0.1 mmol/LEDTA、20 μmol/L 核黃素)，放在光照條件下30 min。最后在可見光光度計(jì)讀取560 nm波長下的吸光值。SOD活性以每mg蛋白抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位U［28］。

(2)抗壞血酸過氧化物氫酶(ascorbate peroxidase(APX))參照Nakano和Asada［29］的方法。取上清液1 mL加入3 mL酶反應(yīng)液(50 mmol/L磷酸緩沖液、1 mmol/L抗壞血酸、2.5 mmol/LH2O2)。最后在290 nm處OD值在0.5 min或1 min內(nèi)的變化，逐漸變小(消光系數(shù)為2.8 mmol·L－1·cm－1)。

(3)過氧化氫酶(catalase(CAT))利用CAT的促進(jìn)H2O2分解，使反應(yīng)體系在240 nm(40 L mmol－1cm－1)處吸光光度值減小的原理測定該酶的活性［30］。酶活性測定的反應(yīng)體系為含有10 mmol/LH2O2的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)。紫外可見分光光度計(jì)讀取240 nm處吸光光度值在3 min內(nèi)每15 s的變化。酶活性以每秒每毫克蛋白分解H2O2的微摩爾數(shù)表示，單位μmol H2O2/minmg蛋白。

(4)過氧化物酶(peroxidase(POD))依照Ekmekci和Terzioglu［31］的方法，反應(yīng)體系包括20 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH值5.0)、1%鄰聯(lián)茴香胺(o－2dianisidine，先溶于甲醇中)、30 mmol/LH2O2和適當(dāng)酶液，測定在460 nm吸光度增加值(消光系數(shù)為11.3 mmol·L－1·cm－1)。

(5)谷胱甘肽(glutathione(GR))參考Sgherri等［32］的方法，反應(yīng)混合物為50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值7.0)、1 mmol/LGSH、0.15 mmol/LNADPH、0.24 單位谷胱甘肽還原酶(GR EC1.6.4.2)、0.1 mmol/LH2O2和酶提取液，加入H2O2啟動反應(yīng)，測定在340 nm下NADPH氧化量(消光系數(shù)為6.22 mmol·L－1·cm－1)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPPSS軟件(SPSS16.0 for windows)進(jìn)行ANOVA分析，Duncan'test法檢驗(yàn)相應(yīng)不同處理間各參數(shù)在置信區(qū)間(P＜0.05)水平上的差異顯著性。

2 研究結(jié)果

2.1 電導(dǎo)率、丙二醛和脯氨酸

在B型凋落物情景下，增溫處理顯著降低了冷杉幼苗丙二醛和自由脯氨酸含量(表1，P＜0.05)。在A型凋落物情景下，增溫處理顯著增加了冷杉幼苗葉片的自由脯氨酸含量?？梢?，與A型凋落物相比，B型凋落物處理下的冷杉幼苗受增溫引起的膜質(zhì)傷害更低，滲透調(diào)節(jié)影響小。在環(huán)境溫度情景下，B型凋落物處理下冷杉幼苗的脯氨酸含量顯著高于A型凋落物。而當(dāng)?shù)蚵湮锱c增溫聯(lián)合情景下，B－T處理使冷杉幼苗的脯氨酸含量顯著低于A－T處理，說明在溫度增加的情景下，B型凋落物能及時(shí)使用其高的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)改善冷杉幼苗受到的膜傷害。

表1 不同類型凋落物和增溫處理下峨眉冷杉幼苗的電導(dǎo)率、丙二醛和自由脯氨酸含量Table 1 The contents of malondialdehyde，electrolyte leakage and free proline in A.fabri needles under two types of litter additional and temperature enhancement

2.2 過氧化氫濃度和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率

在A型凋落物情景下，增溫顯著增加了過氧化氫濃度(圖1，P＜0.05);在B型凋落物情景下，增溫顯著增加了超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率(圖2，P＜0.05)。在環(huán)境溫度情景下，凋落物的類型對過氧化氫和超氧陰離子自由基的產(chǎn)生速率均沒有影響。而當(dāng)增溫與凋落物聯(lián)合下，B－T處理使峨眉冷杉幼苗的過氧化氫含量顯著低于A－T處理?？梢姡跍囟仍黾拥那榫跋?，B型凋落物處理使冷杉幼苗遭受的氧化傷害顯著低于A型凋落物的氧化傷害。

圖1 不同類型凋落物和增溫處理下峨眉冷杉幼苗的過氧化氫的濃度Fig.1 The concentration of H2O2in of A.fabri needles under two types of litters and temperature enhancement

圖2 不同類型凋落物和增溫處理下峨眉冷杉幼苗的超氧陰離子自由基(O－2)產(chǎn)生速率Fig.2 The rate of O－2production in A.fabri needles under two types of litters and temperature enhancement

2.3 非結(jié)構(gòu)性碳水化合物

在A型凋落物情景下，增溫沒有引起峨眉冷杉幼苗可溶性糖和淀粉含量的變化;然而，在B型凋落物情景下，增溫卻顯著降低了幼苗中可溶性糖和淀粉含量(圖3和圖4，P＜0.05)。

2.4 抗氧化酶活性

在凋落物存在情景下，增溫均顯著降低了超氧化物歧化酶(SOD)活性，然而增溫卻增加了過氧化物酶(POD)活性，抗壞血酸過氧化物氫酶(APX)和過氧化氫酶(CAT)活性未受到影響。其中，A型凋落物情景下，與環(huán)境溫度相比，增溫導(dǎo)致峨眉冷杉葉片SOD活性降低了40.24%，POD活性增加了257.89%;B型凋落物情景下，增溫導(dǎo)致SOD活性降低了69.73%，POD活性增加了87.5%?？梢?，增溫引起A型凋落物處理下冷杉葉片的SOD和POD活性改變而造成不利傷害，其傷害遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于B型凋落物。此外，在A型凋落物情景下，增溫導(dǎo)致谷胱甘肽酶活性降低了68.35%，在B型凋落物情景下，卻增加了GR活性179.09%，差異顯著(表2，P＜0.05)。本研究結(jié)果顯示增溫對B型凋落物處理下幼苗的酶活性影響更大。

圖3 不同類型凋落物和增溫處理下峨眉冷杉幼苗的可溶性糖的含量Fig.3 Soluble sugars concentrations of A.fabri seedlings subjected to two types oflittersaddition and temperature enhancement

圖4 不同類型凋落物和增溫處理下峨眉冷杉幼苗的淀粉的含量Fig.4 Soluble starch concentrations of A.fabri seedlings subjected to two types oflittersaddition and temperature enhancement

表2 不同類型凋落物和增溫處理下峨眉冷杉幼苗的抗氧化酶活性Table 2 The effects of two types of litter additional and temperature enhancement on the activities of antioxidant enzymes in A.fabri seedlings

3 討論

植物器官在逆境下易遭受傷害，丙二醛能抑制細(xì)胞保護(hù)酶活性和降低抗氧化物的含量，從而加劇膜脂過氧化，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度［33］。而相對電導(dǎo)率的變化可以反映植物細(xì)胞膜的傷害程度，是衡量樹木抗逆性大小的重要指標(biāo)之一。增溫導(dǎo)致B型凋落物處理下冷杉葉片的丙二醛含量降低，顯示出這一處理下植物受到相對低的氧化傷害。這可能是由于B－T處理下冷杉葉片中的抗壞血酸(APX)、谷胱甘肽(GR)、過氧化氫酶(CAT)活性相對較高，植物保護(hù)酶產(chǎn)生的一種防御反應(yīng)，清除活性氧和自由基的能力增強(qiáng)，植物體內(nèi)的丙二醛含量下降，降低細(xì)胞膜脂氧化，電解質(zhì)滲透也減少。此外，B－T處理下的脯氨酸含量顯著低于A－T處理，也說明其受到的氧化傷害低于A型凋落物處理。另一方面，環(huán)境溫度下，B型凋落物處理下冷杉葉片比A型凋落物處理下具有更高的脯氨酸含量，而當(dāng)賦予增溫聯(lián)合作用時(shí)，B－T處理卻顯示出顯著低于A－T處理的脯氨酸含量，這一結(jié)果說明增溫與B型凋落物發(fā)生了協(xié)同作用，其氧化傷害降低，有利于對冷杉幼苗的生長。

在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的活性氧處于一個較低的水平，當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧，并引起膜脂氧化傷害，而植物體會對此傷害自動產(chǎn)生抗氧化酶以降低活性氧活性，以抵御氧化傷害。目前的研究結(jié)果顯示，與環(huán)境溫度相比，增溫顯著增加了A型凋落物處理下冷杉葉片的過氧化氫濃度和B型凋落物處理下葉片的超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率，說明增溫造成了峨眉冷杉葉片的活性氧含量升高。與此同時(shí)，增溫引起的POD和GR活性顯著增加可能抵御增溫導(dǎo)致的氧化傷害。而在環(huán)境溫度下，A和B兩種類型凋落物處理下的過氧化氫濃度和超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率沒有差異。很明顯，在環(huán)境溫度情景下，A和B兩種類型凋落物對冷杉并未造成氧化傷害，而當(dāng)賦予其環(huán)境溫度增加時(shí)，B－T處理顯示出低于A－T處理的氧化傷害。這一結(jié)果與抗氧化酶活性結(jié)果一致。在環(huán)境溫度情景下，SOD、POD、APX和CAT活性在A、B型兩種類型的凋落物處理下沒有差異，而當(dāng)賦予這兩種凋落物處理下的幼苗環(huán)境溫度增加時(shí)，B型比A型處理下幼苗具有更高的APX、GR、和CAT抗氧化酶活性，這一結(jié)果，也顯示出B型凋落物更有利于冷杉幼苗應(yīng)對氣溫升高引起的氧化傷害。

可溶性糖和淀粉的積累是植物對脅迫的一種適應(yīng)機(jī)制，它對細(xì)胞膜和原生質(zhì)膠體有穩(wěn)定作用，在細(xì)胞內(nèi)無機(jī)離子濃度過高時(shí)起到保護(hù)酶類的作用［34］。本研究結(jié)果顯示，在環(huán)境溫度時(shí)，B型凋落物處理下冷杉幼苗的淀粉含量高于A型凋落物處理(圖4)。更高的淀粉含量說明植物體產(chǎn)生了更多的光合產(chǎn)物［35］，有利于生長。在凋落物情景下，增溫均顯著降低了冷杉幼苗可溶性糖和淀粉的含量。這可能是由于淀粉能參與滲透調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)化為植物自身的結(jié)構(gòu)，從而引起含量降低［8］;當(dāng)升高的溫度會增加植物葉片蒸騰速率，植物為了防止干旱脅迫，降低其可溶性糖含量以降低植物水勢［36］。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示在氣候變暖的情景下，B型凋落物比A型凋落物覆蓋下的峨眉冷杉幼苗具有更高的適應(yīng)溫度增高引起的生理生態(tài)特征改變的能力。Cornelissen［37］等將不同功能型植被凋落物混合后，研究發(fā)現(xiàn)落葉植物葉片的分解速率高于常綠植物葉片。A型凋落物含有75%的常綠冷杉針葉和25%落葉灌木葉，而B型凋落物含有55%常綠冷杉針葉和45%落葉灌木葉，二者物種組成差異導(dǎo)致了不同的分解速率，同時(shí)增溫也可能加快了凋落物的分解［38］?？梢?，增溫環(huán)境下的B型凋落物具有更高的分解速率，更有利于養(yǎng)分的釋放和微生物的活動［18］，因而更有利于植物應(yīng)對未來氣候變暖的環(huán)境。本研究結(jié)果對豐富高海拔地區(qū)森林更新動態(tài)和揭示全球變暖下陸地生態(tài)系統(tǒng)的反饋機(jī)制具有至關(guān)重要的作用。

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