單玲玲,高貴珍,曹穩(wěn)根,段 紅

宿州學院化學與生命科學院,安徽宿州，234000

紫杉醇最早是在20世紀60年代從大平洋紅豆杉的樹皮中提取得到的，作為一種新型微管穩(wěn)定劑，被譽為20世紀抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域中最重大的突破。臨床上紫杉醇已被用于治療多種惡性腫瘤，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸部惡性腫瘤和急性白血病[1]。但由于紫杉醇是一種天然的四環(huán)二萜類物質(zhì)，結(jié)構(gòu)復雜——有一個龐雜的環(huán)狀結(jié)構(gòu)及眾多疏水性取代基，故在水中的溶解性不好，制約了紫杉醇的臨床應(yīng)用，因此，需要開發(fā)溶解性好的紫杉醇前藥[2]。

氨基酸是機體組成的最基本物質(zhì)，也是能量代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)。在腫瘤細胞分裂生長過程中，呈現(xiàn)出對氨基酸的攝取量超過正常組織和細胞，因此，研究者將一些必需氨基酸作為抗腫瘤藥物的載體和Linker，這樣促進腫瘤細胞對藥物的吸收和攝取，同時也可改善化學藥物的水溶性，提高藥物的生物利用度[3]。在抗腫瘤藥物研究中，如何利用氨基酸改造藥物成為研究熱點[3]。在眾多氨基酸中，谷氨酸是藥物改造的首選Linker，這是因為谷氨酸是機體必需氨基酸，主要參與機體的氮代謝和能量代謝。有研究證明，在腫瘤組織生長中，谷氨酸是關(guān)鍵性的氨基酸，腫瘤細胞對其攝取率遠遠高于正常組織，同時也高于其他任何一種氨基酸[4]。離體實驗表明：乳腺癌細胞中谷氨酰胺合成酶mRNA表達水平顯著增高[5]，合成的谷氨酸主要用于能量代謝?；铙w實驗顯示：腫瘤組織對谷氨酸的攝取量是正常組織的2倍[6]，因此，將谷氨酸作為化學藥物的Linker，不僅可提高其水溶性，也可為合成高效低毒的前藥提供新途徑。

本課題旨在制備紫杉醇前藥谷氨酸-紫杉醇，評價紫杉醇前藥的理化性質(zhì)、釋藥特征及藥效，用熒光染料(FITC)標記谷氨酸-紫杉醇，從體外直觀證明紫杉醇前藥的藥效特征，為尋求低毒、高效小分子改造紫杉醇提供科學的實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

紫杉醇(分析純，江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司)，谷氨酸(分析純，美國Sigma公司)，熒光染料FITC(分析純，美國sigma公司)；Model 580酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Rad公司)，熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 紫杉醇-谷氨酸的合成

稱取100 mg(0.117 mmol)PTX溶于15 mL的DCM，同時用59.7 mg(0.140 4 mmol)Fmoc-Glu(OtBu)OH和14.29 mg(0.117 mmol)催化劑DMAP，室溫(19℃)攪拌22 h。待反應(yīng)結(jié)束后，用同體積的DCM稀釋，然后用同體積的蒸餾水洗2次，加入無水硫酸鎂干燥，真空旋蒸后，即得晶狀體產(chǎn)物Fmoc-Glu(OtBu)-PTX。脫去Fmoc得到紫杉醇-谷氨酸。

1.3 紫杉醇-谷氨酸-FITC的制備

將谷氨酸-紫杉醇溶于DMF中，加入0.01 mmol FITC,-4℃攪拌3 h，將反應(yīng)液經(jīng)G25純化，得到純化的紫杉醇-谷氨酸-FITC。

1.4 釋藥動力學觀察

通過紫杉醇前藥在不同溶液中酯鍵斷裂的實驗，觀察紫杉醇前藥在體外釋藥動力曲線的特征。

1.5 體外毒性和細胞攝取

1.5.1 細胞MTT實驗

在96孔板的每個孔中，加入乳腺癌細胞(MDA-MB)和卵巢癌(SKOV3)，在37℃、二氧化碳濃度為5%的條件下，孵育48 h后，分別加入紫杉醇、紫杉醇-谷氨酸和紫杉醇-谷氨酸-FITC三種前藥，紫杉醇的濃度為1 mg/mL。設(shè)空白組和對照組。感染48 h天后，在470 nm處的吸光值可用酶標儀進行測定。通過如下公式進行計算得到[7]：

Viable Rate(%)=(ODtreated/ODcontrol)×100%。

1.5.2 腫瘤細胞攝取前藥的觀察

通過體外細胞攝取實驗，用FITC標記氨基酸-紫杉醇，考察乳腺癌細胞(MDA-MB-231)對紫杉醇前藥的攝取，初步分析其靶向性的機理。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷氨酸-紫杉醇前藥結(jié)構(gòu)鑒定

純化后的-NH2-Glu(OtBu)-PTX用LC-MS分析，其質(zhì)譜鑒定結(jié)果(m/z=479 [M-1]-)也與-NH2-Glu(OtBu)-PTX的理論分子量完全一致，-NH2-Glu(OtBu)-PTX:MS(ESI,m/z):1283.4([M+Na]+)如圖1。證明已成功合成谷氨酸-紫杉醇前藥。

圖1 谷氨酸-紫杉醇前藥用LC-MS的結(jié)構(gòu)鑒定

2.2 谷氨酸-紫杉醇前藥釋放曲線

圖2 谷氨酸-紫杉醇前藥

在三種不同溶液中釋藥動力學曲線

將Glu-PTX孵育在37℃的PBS、血漿和細胞培養(yǎng)液中，按照不同的時間點取100 uL樣品。圖2顯示，在孵育4 h后，在PBS中Glu-PTX藥物釋放為15.8%，血漿中的釋放率是26.3%，細胞培養(yǎng)液中孵育的釋放率為37.8%。由圖2可以看出,前藥在PBS中釋放速度最慢，在細胞培養(yǎng)液中釋放速度最快，在血漿中的釋放速度處于中間狀態(tài)，這與細胞培養(yǎng)液和血漿中含酶有關(guān)。

2.3 谷氨酸-紫杉醇前藥的細胞抑制率

用MTT法檢測谷氨酸-紫杉醇前藥對MDA-MB-231和SKOV3細胞的抑制活性，實驗結(jié)果如圖3。

從圖3可以看出，藥物對MDA-MB-231和SKOV3細胞的作用與藥物的濃度有明顯的依賴性，藥物濃度越大對腫瘤細胞的抑制性越強。兩種前藥對腫瘤細胞的抑制性略低于PTX單體，表明利用2位羥基修飾PTX可降低其細胞毒性。藥物對MDA-MB-231和SKOV3兩種腫瘤細胞的抑制作用相比，藥物對MDA-MB-231的抑制率高于SKOV3，說明紫杉醇和紫杉醇前藥對MDA-MB-231腫瘤細胞的抑制作用優(yōu)于對SKOV3的作用。

圖3 紫杉醇前藥在MDA-MB-231和SKOV3兩種腫瘤細胞中的抑制作用(mean±SD,n=6)

2.4 紫杉醇前藥在乳腺癌細胞中的攝取

用六孔板孵育MDA-MB-231細胞，加入FITC標記谷氨酸-紫杉醇前藥并孵育12 h，由圖4可觀察到紫杉醇前藥已進入腫瘤細胞，分析其結(jié)果，主要是因為紫杉醇前藥提高了紫杉醇藥物的水溶性，使腫瘤細胞對藥物的攝取量增加。

圖4 谷氨酸-紫杉醇前藥在乳腺癌MDA-MB-231細胞中攝取

3 結(jié) 論

本實驗成功制備了谷氨酸-紫杉醇前藥，并用熒光染料標記紫杉醇前藥，實驗結(jié)果顯示谷氨酸-紫杉醇前藥具有良好的釋藥動力曲線，而對腫瘤細胞毒性較小，但可增加腫瘤細胞對其攝取量，這為改造紫杉醇提供了新途徑。

參考文獻：

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