李留霞 ，張?zhí)m蘭，李秀芳，張建營，王凱娟，代麗萍，王 鵬，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院;鄭州大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用研究中心 鄭州450001 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心;鄭州大學(xué)生物工程系 鄭州450052

#通訊作者，女，1962年6月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向:婦科腫瘤、婦科內(nèi)分泌疾病及不孕不育，E-mail:llxia698@163.com

卵巢癌(ovarian cancer，OC)病死率居婦科惡性腫瘤之首，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，位居第3［1］。目前協(xié)助診斷卵巢癌的腫瘤標志物主要是血清CA125，但其敏感性和特異性均不理想，尤其是對早期卵巢癌診斷價值不大。研究［2-4］發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血清中存在各種類型的抗腫瘤細胞自身抗原的抗體，這些與腫瘤發(fā)生有關(guān)的抗原被稱為腫瘤相關(guān)抗原(tumor-associated antigen，TAA)。有研究［5-8］顯示P53、Survivin、IMP1、Cyclin D1、C-myc 和Cyclin E 在OC組織中呈現(xiàn)高表達，理論上推測這些抗原應(yīng)該能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體。該研究通過對卵巢癌患者血清中上述6 種TAAs 抗體及CA125 進行檢測，探討TAAs 抗體聯(lián)合CA125 檢測對診斷早期卵巢癌的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 該研究中使用的血清標本來自2011年1月至2012年1月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院、鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院首次住院治療的卵巢腫瘤患者，經(jīng)知情同意后收集血清，立即凍存于－20℃冰箱，所有病例均經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)證實。①OC組78例，患者年齡23～79 歲;包括漿液性囊腺癌63例，黏液性囊腺癌15例;FIGO 臨床分期:Ⅰ、Ⅱ期28例，Ⅲ、Ⅳ期50例。②卵巢良性上皮性腫瘤組60例，患者年齡26～71 歲。③正常對照組血清100例，采集于在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院進行健康體檢并證實無任何腫瘤相關(guān)疾患的健康女性，年齡21～65 歲。

1.2 主要試劑及儀器 P53、Survivin、IMP1、Cyclin D1、C-myc 和Cyclin E 抗體由美國德克薩斯州大學(xué)生命科學(xué)系腫瘤免疫和腫瘤分子流行病學(xué)研究室提供。96 孔酶標板系Gibico 公司產(chǎn)品。酶標儀為美國Tecan 公司Sunrise 酶標儀。其他試劑如過氧化氫尿素顯色液(TMB)、辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG(HRP-APS)等均由鄭州大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用研究中心饋贈。

1.3 6 種TAAs 抗體的ELISA 法檢測 采用Zhang 等［9-15］建立的間接ELISA 法:將各種抗原以0.5 g/L 的質(zhì)量濃度包被96 孔板;一抗與待測血清按1:100 稀釋，PBS 作為空白對照，每孔加100 μL，37℃孵育1 h，PBST 洗板3 次;二抗辣根過氧化物酶標記的葡萄球菌A 蛋白(HRP-APS，按1:4 000 稀釋)，每孔100 μL，37℃孵育1 h，PBST 洗板3 次，PBS 洗板1 次;每孔加入TMB 顯色液100 μL，37℃避光反應(yīng)至充分顯色;加終止液50 μL，立即在自動酶標儀上讀取450 nm 吸光度(A)值，空白孔調(diào)零。結(jié)果判定:樣品血清每份做2 孔，取平均值判斷結(jié)果，空白孔調(diào)零;選擇7 個正常血清和2 個卵巢癌患者血清作為判斷每批ELISA 試驗之間可靠性的指標;100例正常人血清A 值的平均值加2 個標準差為判斷臨界值，即截斷值，高于此值為陽性，低于此值為陰性。

1.4 CA125 的測定 采用電化學(xué)發(fā)光免疫測定法(ECLIA)，按說明書提供的實驗程序檢測血清CA125 的水平。儀器:德國寶靈曼公司Elecsys 2010全自動免疫分析儀。檢測指標采用正常值上限，即CA125 ＞35 kU/L 為陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進行分析，應(yīng)用χ2檢驗及精確概率法分析不同組合間各種率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 6 種TAAs 抗體原的檢測結(jié)果及真實性評價見表1。由表1可知，卵巢癌患者血清中每種TAA抗體陽性率均明顯高于正常人血清。這6 種TAAs的抗體陽性率最低為11.5%，最高為35.9%。而正常人抗體陽性率均較低，為2.0%～6.0%。

2.2 不同TAAs 抗體組合的檢測結(jié)果及評價 見表2。6 種TAAs 聯(lián)合CA125 檢測時其約登指數(shù)為0.722，陽性似然比為4.01，陰性似然比為0.05，一致率為84.83%，Kappa 值為0.701。

表1 6 種TAAs 抗體的檢測結(jié)果及真實性評價

2.3 6 種TAAs 抗體聯(lián)合CA125 檢測的結(jié)果及綜合性評價 見表3、4。由表3可知，CA125 陰性的10例早期卵巢癌患者中，6 種TAAs 抗體聯(lián)合檢測陽性者為7例。6 種TAAs 聯(lián)合CA125 檢測對早期卵巢癌的檢測陽性率明顯高于單獨應(yīng)用CA125 檢測的陽性率，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=4.909，P=0.027)。由表4可知，6 種TAAs 聯(lián)合CA125 檢測對卵巢癌的檢測陽性率明顯高于卵巢良性腫瘤組和正常對照組。

表2 不同TAA 抗體組合的檢測結(jié)果評價

表3 不同分期卵巢癌患者中TAAs 抗體及CA125 的檢測結(jié)果 陽性例數(shù)(%)

表4 3組對象6 種TAAs 抗體聯(lián)合CA125 檢測結(jié)果分析

3 討論

腫瘤標志物由腫瘤組織自身產(chǎn)生，是一類可反映腫瘤存在和生長的生化物質(zhì)，它對于腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、病情監(jiān)測及靶向性治療具有重要意義。卵巢癌患者死亡率居婦科惡性腫瘤之首，其總體5 a 生存率為45%，且其發(fā)病率呈上升趨勢［14］。在普通女性人群中，發(fā)生卵巢癌的風(fēng)險為1.4%，而在某些高危婦女中風(fēng)險更高。由于大多數(shù)卵巢癌臨床診斷時已處于晚期，迫切需要一種能夠早期臨床診斷的方法。雖然目前已經(jīng)找到了一些腫瘤標記物，而且在超聲輔助下可明顯增加診斷的靈敏度和特異性，但仍未達到滿意結(jié)果［16］。

在卵巢癌細胞中CA125 有高度表達，并能分泌入血液，目前已作為一種常規(guī)的血清標志物應(yīng)用于卵巢癌患者的病情監(jiān)測，并已成為臨床上應(yīng)用最廣的卵巢癌腫瘤標志物，但由于在排卵期、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、盆腔炎癥等生理及病理情況下也會導(dǎo)致CA125 升高，所以應(yīng)用CA125 診斷卵巢癌的特異性不高，而且早期卵巢癌CA125 檢測陽性率僅27%～66%［16］。有學(xué)者［17］提出采用TAAs 抗體作為血清標志物來診斷癌癥，但是研究結(jié)果顯示單個TAAs 抗體檢測的靈敏度比較低，一般為10%～30%，不宜作為臨床檢測指標，Zhang［9-15］等采用精心篩選出的TAAs 抗體聯(lián)合檢測，可使檢測的靈敏度提高到63.6%。

該研究選取6 種TAAs 抗體聯(lián)合CA125 來檢測卵巢癌，結(jié)果顯示單個抗體檢測的靈敏度較低，而聯(lián)合檢測可顯著提高檢測的靈敏度，6 種TAAs 聯(lián)合檢測的靈敏度達到55.1%，特異度為87.0%。6 種TAAs 抗體聯(lián)合CA125 的檢測靈敏度為96.2%，特異度為76.0%，該組合檢測的陽性似然比為4.01，陰性似然比為0.05，陽性預(yù)測值為75.8%，陰性預(yù)測值為96.2%，提示該方法的診斷價值較高;Kappa值為0.701，提示該試驗的檢測結(jié)果與真實值高度一致;6 種TAAs 抗體聯(lián)合CA125 檢測對早期卵巢癌的檢測陽性率為89.3%，明顯高于單獨應(yīng)用CA125 檢測的陽性率，表明6 種TAAs 抗體與CA125 聯(lián)合可彌補CA125 單獨應(yīng)用時診斷早期卵巢癌陽性率較低的不足，起到了互補作用，可望成為早期卵巢癌的診斷方法。

綜上所述，采用篩選出的6 種TAAs 抗體聯(lián)合CA125 檢測對卵巢癌的早期診斷可能具有重要的參考價值。

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