宋 洋，王 嚴(yán)，余伯陽(yáng)，劉吉華

(中國(guó)藥科大學(xué)中藥復(fù)方研究室，江蘇南京211198)

左旋四氫巴馬汀(l－tetrahydropalmatine，l-THP)是由防己科植物華千金藤(Stephania sinica Diels)中提取的一種異喹啉類生物堿，為中藥罌粟科植物延胡索(Corydalis yanhusuo W.T.Wang)有效成分延胡索乙素的左旋體［1］，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和催眠作用。左旋紫堇達(dá)明(l－corydalmine，l－CDL)是l－THP 10位羥基化的產(chǎn)物，研究表明，由于l－CDL電子云密度和結(jié)構(gòu)扭曲度增加，與多巴胺受體的親和力增大，其鎮(zhèn)痛活性顯著強(qiáng)于 l－THP［2］，且鎮(zhèn)靜催眠作用較弱。由于l－CDL屬于中藥中的微量成分，自然來(lái)源十分有限。與大多數(shù)生物堿一樣，l－CDL具有復(fù)雜的稠環(huán)結(jié)構(gòu)，難以通過(guò)化學(xué)合成或結(jié)構(gòu)修飾方法獲得［3］。

微生物轉(zhuǎn)化(Microbial Conversion)，是利用微生物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的某個(gè)或某一系列的酶對(duì)底物進(jìn)行的催化反應(yīng)［4］，與傳統(tǒng)的有機(jī)反應(yīng)相比，具有區(qū)域選擇性高、立體選擇性強(qiáng)和反應(yīng)類型眾多等特點(diǎn)，并能完成一些化學(xué)方法難以實(shí)現(xiàn)的反應(yīng)［5］。目前微生物轉(zhuǎn)化已成為天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)修飾的重要手段［6］，通過(guò)先導(dǎo)化合物經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化方法尋找新的高活性、低毒性的藥物已成為有效開(kāi)發(fā)新藥的一條途徑。前期研究表明，Streplomyces griseus ATCC 13273具有生物轉(zhuǎn)化l－THP生成l－CDL的活性，由包括細(xì)胞色素P450酶的復(fù)雜酶系所催化。對(duì)生物轉(zhuǎn)化體系中催化反應(yīng)的酶或酶系進(jìn)行誘導(dǎo)可在不增加生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上極大提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率［7］，為后續(xù)的工業(yè)放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究在現(xiàn)有生物轉(zhuǎn)化合成左旋紫堇達(dá)明體系的基礎(chǔ)上，以苯甲酸、正己烷、苯巴比妥鈉為誘導(dǎo)物，通過(guò)篩選生物轉(zhuǎn)化體系的誘導(dǎo)劑并優(yōu)化誘導(dǎo)條件，提高l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

灰色鏈霉菌 (Streptomyces griseus ATCC 13273)，本研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面及平板培養(yǎng)基(g/L):土豆200，磷酸二氫鉀3，葡萄糖 20，硫酸鎂 0.73，瓊脂粉 20，維生素B10.01。

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米粉30，磷酸氫二鉀5，豆粕粉7.6，氯化鈉5，酵母粉5，硫酸鎂0.1，硫酸亞鐵 0.1，葡萄糖 1.2。

1.1.3 儀器及試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀;SW－CJ－IF超凈工作臺(tái);LRH－250A生化培養(yǎng)箱;QHZ－DA全溫大容量振蕩培養(yǎng)箱;左旋四氫巴馬汀(成都曼思特生物科技有限公司)，左旋紫堇達(dá)明(本實(shí)驗(yàn)室分離純化，HPLC檢測(cè)純度大于98%)。甲醇為色譜純，乙酸乙酯，丙酮，正己烷均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及液體菌種制備

將保藏的S.griseus ATCC 13273菌種轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上，28℃活化培養(yǎng)6 d。以活化的斜面菌種轉(zhuǎn)接液體種子培養(yǎng)基，于28℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h即得液體菌種，發(fā)酵轉(zhuǎn)化時(shí)以4%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基相同條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化。

1.2.2 l－THP 的微生物轉(zhuǎn)化

向加入誘導(dǎo)物的轉(zhuǎn)化體系中加入終濃度為0.4 mg/mL轉(zhuǎn)化底物l－THP(丙酮助溶)，28℃，180 r/min轉(zhuǎn)化發(fā)酵96 h，HPLC檢測(cè)l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。

1.2.3 誘導(dǎo)劑的篩選及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

誘導(dǎo)劑的篩選:液體菌種轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)10 h，分別加入苯甲酸或正己烷作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后加入l－THP，水溶性苯巴比妥鈉于轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)加入。相同條件不加誘導(dǎo)物的轉(zhuǎn)化體系為對(duì)照。比較各組l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，篩選轉(zhuǎn)化體系的誘導(dǎo)劑。

誘導(dǎo)條件的優(yōu)化:以單因素試驗(yàn)方法，對(duì)影響誘導(dǎo)效果的誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 l－CDL 轉(zhuǎn)化產(chǎn)率測(cè)定

發(fā)酵液以等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并減壓濃縮至干，殘?jiān)蒙V甲醇溶解定容至20 mL，微孔濾膜過(guò)濾即得HPLC分析樣品。HPLC分析條件為色譜柱:Hedera C18;流動(dòng)相:0.6%乙酸水溶液(含0.06%三乙胺)－乙腈(77∶23);流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):281 nm;柱溫:28℃;進(jìn)樣量:15 μL。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)劑的篩選

參考相關(guān)文獻(xiàn)［8］，選擇苯甲酸、正己烷、苯巴比妥鈉為l－CDL轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)物，考察其對(duì)l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的影響。結(jié)果(表1)顯示:苯甲酸、正己烷、苯巴比妥鈉均能顯著提高l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，表明所選誘導(dǎo)物對(duì)S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL的轉(zhuǎn)化活性均有誘導(dǎo)作用。

表1 三種誘導(dǎo)物對(duì)S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL產(chǎn)率的影響

2.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.2.1 苯甲酸作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)條件優(yōu)化

苯甲酸類物質(zhì)是芳香族化合物代謝中最常見(jiàn)的中間產(chǎn)物。在微生物中，由細(xì)胞色素P450酶催化的羥基化反應(yīng)是苯甲酸的主要降解途徑之一，苯甲酸對(duì)相應(yīng)的細(xì)胞色素P450酶也有明顯的誘導(dǎo)作用［9］。

2.2.1.1 苯甲酸濃度對(duì)轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)作用的影響

液體菌種轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，180 r/min培養(yǎng)10 h后，分別加入苯甲酸使其終濃度為1，2，3 mmol/L，按誘導(dǎo)劑優(yōu)化方法進(jìn)行 l－ THP 轉(zhuǎn)化，HPLC檢測(cè)。結(jié)果(表2)顯示:轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基中苯甲酸終濃度為2 mmol/L時(shí)l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到69.71%，對(duì)轉(zhuǎn)化體系生物轉(zhuǎn)化合成l－CDL活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。

表2 苯甲酸對(duì)濃度S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL產(chǎn)率的影響

2.2.1.2 苯甲酸誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)作用的影響

液體菌種轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，180 r/min培養(yǎng)10 h后，加入終濃度為2 mmol/L苯甲酸，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)6、9、12 h后進(jìn)行l(wèi)－THP生物轉(zhuǎn)化。結(jié)果(表3)顯示:2 mmol/L苯甲酸誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h，轉(zhuǎn)化體系具有最高轉(zhuǎn)化能力，l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到79.57%。

表3 苯甲酸誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的影響

2.2.2 正己烷作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)條件優(yōu)化

正己烷對(duì)多種微生物的細(xì)胞色素P450酶都有明顯的誘導(dǎo)作用，而且誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞色素P450酶具有多樣的功能，因而被稱作細(xì)胞色素P450酶的多功能誘導(dǎo)劑。

2.2.2.1 正己烷濃度對(duì)轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)作用的影響

液體菌種轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，180 r/min培養(yǎng)10h后，分別加入 1，2，3 μL/(mL·h)的正己烷，按誘導(dǎo)劑優(yōu)化方法進(jìn)行l(wèi)－THP轉(zhuǎn)化，HPLC檢測(cè)。結(jié)果(表4)顯示:加入正己烷2μL/(mL·h)時(shí)l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到62.86%，對(duì)轉(zhuǎn)化體系生物轉(zhuǎn)化合成l－CDL活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。

表4 正己烷濃度對(duì)S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的影響

2.2.2.2 正己烷誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)作用的影響

液體菌種轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃，180 r/min培養(yǎng)10 h后，加入2μL/(mL·h)正己烷，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)6、9、12 h后進(jìn)行l(wèi)－THP生物轉(zhuǎn)化。結(jié)果(見(jiàn)表5)顯示:加入2μL/(mL·h)的正己烷，誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h，轉(zhuǎn)化體系具有最高轉(zhuǎn)化能力，l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到69.84%。

表5 正己烷誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的影響

2.2.3 苯巴比妥鈉作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)條件優(yōu)化

苯巴比妥鈉是典型的、最先發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞色素P450酶的誘導(dǎo)劑，在微生物細(xì)胞色素P450酶活性調(diào)控中常被采用［10］。

2.2.3.1 苯巴比妥鈉濃度對(duì)轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)作用的影響

液體菌種轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基的同時(shí)，分別加入苯巴比妥鈉使其終濃度為 0.15，0.75，1.50 mmol/L，按誘導(dǎo)劑優(yōu)化方法進(jìn)行l(wèi)－THP轉(zhuǎn)化，HPLC檢測(cè)。結(jié)果(表6)顯示:轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基中苯巴比妥鈉終濃度為1.5 mmol/L時(shí) l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到66.12%，對(duì)轉(zhuǎn)化體系生物轉(zhuǎn)化合成l－CDL活性誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。

表6 苯巴比妥鈉濃度對(duì)S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的影響

2.2.3.2 苯巴比妥鈉誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化體系誘導(dǎo)作用的影響

液體菌種轉(zhuǎn)接轉(zhuǎn)化發(fā)酵培養(yǎng)基的同時(shí)，加入終濃度為1.5 mmol/L的苯巴比妥鈉，分別誘導(dǎo)培養(yǎng)12、16、20 h后進(jìn)行 l－THP生物轉(zhuǎn)化。結(jié)果(見(jiàn)表7)顯示:1.5 mmol/L苯巴比妥鈉誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)化體系具有最高轉(zhuǎn)化能力，l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)到74.57%。

表7 苯巴比妥鈉誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率的影響

3 討論

近年來(lái)，微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)已經(jīng)廣泛用于中藥活性成分的結(jié)構(gòu)修飾以及藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)［11］，在中藥研究的多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。研究表明，S.griseus ATCC 13273轉(zhuǎn)化合成l－CDL是由包括細(xì)胞色素P450酶的復(fù)雜酶系所催化，轉(zhuǎn)化體系的催化活性的提高可在不增加成本的條件下極大提高轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率。本研究以l－CDL轉(zhuǎn)化產(chǎn)率為指標(biāo)，比較苯甲酸、正己烷、苯巴比妥鈉對(duì)轉(zhuǎn)化合成l－CDL活性的影響并優(yōu)化其誘導(dǎo)條件，顯著的提高了l－CDL的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，為其后續(xù)的放大發(fā)酵奠定了基礎(chǔ)。

從來(lái)源廣泛，不影響產(chǎn)物分離考慮，優(yōu)選正己烷為生物轉(zhuǎn)化合成l－CDL的合適誘導(dǎo)劑。同時(shí)正己烷對(duì)轉(zhuǎn)化底物l－THP具有良好的溶解性，在轉(zhuǎn)化體系中可同時(shí)起到轉(zhuǎn)化活性誘導(dǎo)及底物助溶的作用。

［1］ 張文偉，余伯陽(yáng)，彭娟.左旋四氫巴馬亭生物轉(zhuǎn)化為左旋紫堇達(dá)明的研究［J］.藥物生物技術(shù)，2003，10(3):165.

［2］ 余伯陽(yáng).中藥生物技術(shù)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2005:274.

［3］ 徐田，劉吉華，余伯陽(yáng).微生物轉(zhuǎn)化左旋四氫巴馬汀產(chǎn)生左旋紫堇達(dá)明高產(chǎn)菌株的紫外誘變選育［J］.藥物生物技術(shù)，2011，18(4):313－316.

［4］ 楊若林，鄭桂蘭，張榮慶.黃柏酮微生物轉(zhuǎn)化研究［J］.中草藥，2007，38(10):1471 －1472.

［5］ Haq N B，Rasheed A K.Biological transformations of steroidal compounds:A review［J］.Steroids，2012，77(12):1267 －1290.

［6］ Lirui Q，Dan X，Jungui D，et al.Microbial transformation of lovastatin by Beauveria bassiana［J］.Acta Pharmaceutica Sinica B，2012，2(3):300 －305.

［7］ 呂斯琦，馬琳，孫靜，等.中藥微生物轉(zhuǎn)化的現(xiàn)狀及前景［J］.藥物評(píng)價(jià)研究，2010，33(6):447 －451.

［8］ 寧大亮.白腐真菌細(xì)胞色素P450轉(zhuǎn)化難降解有機(jī)物的功能研究［D］.北京:清華大學(xué)，2008.

［9］ Fumiko M，Hiroyuki W.Functional diversity of cytochrome P450s of the white－rot fungus Phanerochaete chrysosporium［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2004，324(1):387－393.

［10］ Sueyoshi T，Negishi M.Phenobarbital response elements of cytochrome P450 genes and nuclear receptors［J］.Annu Rev Pharmacol Toxicol，2001，41:123 －143.

［11］ 高寧，程玉鵬，畢珊珊，等.微生物轉(zhuǎn)化在中藥活性成分研究中的應(yīng)用［J］.中醫(yī)藥信息，2011，28(5):18 －20.