閔子揚 ，童龍 ，李玲 ，王志偉 ，唐炎英 ，肖璐 ，李涵 ，孫小武 ,3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學，長沙，410128；2.湖南省農(nóng)科院；3.湖南省瓜類研究所）

葫蘆科（Cucurbitaceae）植物包括118個屬共825個種，廣泛分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)。中國分布約有29個屬，142個種，其中大部分是人們喜愛的瓜類蔬菜作物如西瓜（Citrullus lanatus）、黃瓜（Cucumis sativus.L.）、 苦瓜 （Momordica charantia L.）、 南 瓜（Cucurbita pepo L.）等。葫蘆科是世界上最重要的食用植物科之一，僅次于禾本科、豆科和茄科，在人們生活中具有重要的作用[1]。

葫蘆科植物在常規(guī)育種過程中存在育種年限長、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定等情況，嚴重制約了葫蘆科植物在生產(chǎn)上的進一步利用。近年來，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟，為這一問題的解決帶來了曙光。游離小孢子技術(shù)研究于20世紀70年代初開始，1982年在蕓薹屬作物上首次獲得成功[2]。小孢子是直接從花藥或花蕾中游離出來的天然分散的細胞，具有單倍體和單細胞的特性。游離小孢子培養(yǎng)是指直接培養(yǎng)植物小孢子，誘導小孢子胚胎發(fā)生和植株再生，經(jīng)染色體加倍后直接獲得遺傳上純合的雙單倍體株系（DH），從而大大簡化常規(guī)育種中自交純合程序，縮短育種年限，加速蔬菜新品種選育。近年來，游離小孢子培養(yǎng)已經(jīng)在大白菜、胡蘿卜、青花菜、辣椒、茄子、小麥、大麥等作物上獲得了再生的單倍體植株，但是在葫蘆科植物上的研究還相對較少，僅在黃瓜[3]和西瓜[4]上獲得了胚狀體或再生植株。為了總結(jié)前人在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)上的研究成果，為以后的相關(guān)研究提供指導，對葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的影響因素進行了綜述。

1 供體植株對小孢子胚胎發(fā)生的影響

供體植株對小孢子胚胎發(fā)生的影響主要體現(xiàn)在植株的基因型、植株生長狀況和生長環(huán)境、小孢子發(fā)育時期等方面。

1.1 基因型

基因型對小孢子培養(yǎng)中胚狀體的發(fā)生具有決定性作用，不同基因型材料在相同的培養(yǎng)條件下成胚率有很大差異。詹艷等[3]對10份黃瓜的供試材料進行研究發(fā)現(xiàn)，只有4份試材獲得了胚狀體，其中成胚率最高的是“7447”，為每皿31.2個，最低的是“康德”，為每皿1.5個。剩余的6份材料中有些游離小孢子出現(xiàn)膨大，有些已啟動分裂，但均未能繼續(xù)分裂形成胚狀體。李娟等[4]在西瓜上的試驗發(fā)現(xiàn)，野生種和栽培種的成胚率有顯著差別，前者要高于后者。緱艷霞[5]和董艷榮[6]分別在西瓜和甜瓜花藥培養(yǎng)試驗中得出F1代植株的愈傷組織誘導率明顯大于親本，表現(xiàn)雜種優(yōu)勢，說明小孢子的基因型至少是決定培養(yǎng)能力的因素。

1.2 植株的生長狀況和環(huán)境

供體植株的生長狀況和生長環(huán)境對小孢子的胚胎發(fā)生也有重要影響。有研究表明，如果在小孢子的形成過程中遇到連續(xù)的陰雨天氣或者是嚴重的光照不足，小孢子的活力就會嚴重降低以至于影響小孢子的成胚率。張鳳蘭等[7]利用人工氣候室研究了光照和溫度對小孢子胚胎發(fā)生的影響，結(jié)果表明，光照時數(shù)為14 h、溫度為20℃時最利于小孢子胚胎的發(fā)生，產(chǎn)胚量最高。曹鳴慶等[8]報道生長在日照14～16 h、溫度15～20℃條件下的植株在小孢子培養(yǎng)的過程中成胚率最高。供體植株的栽培季節(jié)對獲得較高活力的小孢子也非常重要，謝淼等[9]利用取自不同季節(jié)的黃瓜花藥進行小孢子培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于季節(jié)的不同，所接種黃瓜花藥的誘導率不同，秋季的誘導率低于春季。另外，供體植株的營養(yǎng)狀況也是影響小孢子胚胎發(fā)生的重要因素，供體植株栽培密度過大則小孢子的成胚率降低[10]。

1.3 小孢子的發(fā)育時期

小孢子的發(fā)育時期是影響小孢子培養(yǎng)效果的重要因素[11]?；ǚ坌℃咦影l(fā)育可分為四分體時期、單核期、雙核期和三核期，單核期又可細分為單核早期、單核中期和單核晚期。因細胞具有全能性，理論上所有時期的小孢子都能發(fā)育成為一個完整的植株，但是實際上只有那些處于特定時期的小孢子才能在離體條件下從配子體發(fā)育途徑經(jīng)誘導轉(zhuǎn)變?yōu)殒咦芋w發(fā)育途徑，最終形成胚狀體。詹艷[12]探究了3份黃瓜材料不同小孢子發(fā)育時期對小孢子成胚率的影響，結(jié)果表明，只有單核靠邊期的小孢子才能誘導成胚。董艷榮[6]關(guān)于甜瓜的研究表明，花藥培養(yǎng)的最佳時期是單核靠邊期到雙核期，李娟[4]在西瓜中也有類似報道。目前的研究結(jié)果表明，小孢子處于單核靠邊期時誘導成胚率都是最高的。

小孢子的發(fā)育階段跟花蕾的外部形態(tài)有密切關(guān)系，通過對花蕾外部形態(tài)如長度、顏色的觀察可以大致確定小孢子所處的發(fā)育階段。葫蘆科不同植物小孢子培養(yǎng)的最適花蕾長度見表1，但是Turlingn[13]在進行油菜花藥培養(yǎng)時曾指出，雖然花蕾大小是判斷小孢子發(fā)育階段的可靠指標，但它也隨著供體植株的基因型、生長條件、發(fā)育階段和花序等的變化而變化，所以花蕾長度只能作小孢子發(fā)育時期的參考指標，具體發(fā)育時期還要進一步鑒定。

表1 一些葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的最適花蕾長度

2 培養(yǎng)基及其成分對小孢子胚胎發(fā)生的影響

培養(yǎng)基的種類和成分對小孢子胚胎發(fā)生的影響顯著，主要因素為基本培養(yǎng)基的種類、碳源物質(zhì)種類、培養(yǎng)基中添加的激素種類和濃度以及是否添加活性炭。

2.1 基本培養(yǎng)基的種類

在大多數(shù)葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)中所用的基本培養(yǎng)基都是MS，但是也有一些其他的報道。蘇華等[17]研究了B5，MS，Nitsch，N6四種基本培養(yǎng)基對黃瓜花藥培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基中MS對津春3號的愈傷組織誘導率顯著低于其他培養(yǎng)基。詹艷等[3]指出在黃瓜游離小孢子培養(yǎng)中，NLN和B5作為基本培養(yǎng)基時獲得的胚狀體產(chǎn)量差異不顯著，但NLN更有利于球形胚進一步發(fā)育形成子葉形胚。董艷榮[6]將MS培養(yǎng)基中的Fe-EDTA、Mg2SO4·7H2O和VB1增加一倍得到改良的MS培養(yǎng)基MSKI，用作甜瓜的小孢子培養(yǎng)取得了良好的效果。

2.2 碳源

葫蘆科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中使用的碳源和滲透調(diào)節(jié)劑以蔗糖為主，其類型和濃度對小孢子存活以及胚狀體的形成具有很大的影響，不同作物的最適蔗糖濃度有所差別，但以13%最為有利[3，18]。在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)時也有一些使用麥芽糖的報道，但是關(guān)于這兩種碳源到底哪一種更有利于小孢子的培養(yǎng)目前還未見報道，僅陳振光[19]、何艷等[20]在苦瓜的花藥培養(yǎng)中得出蔗糖作為碳源比麥芽糖更有利的結(jié)論。在十字花科蔬菜的小孢子培養(yǎng)中有在培養(yǎng)初期使用較高濃度蔗糖（17%）以保持小孢子的活力，一定時間（1～4 d）后加液稀釋或更換培養(yǎng)基降低蔗糖濃度到10%～14%來促進小孢子分裂可以顯著提高胚產(chǎn)量的報道[21]，但這種方法在葫蘆科蔬菜上還未見報道，有待進一步研究。

2.3 激素

在葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)過程中，激素的種類和配比對胚狀體的形成起著至關(guān)重要的作用。經(jīng)常使用的激素有生長素和細胞分裂素兩大類，前者包括 2，4-D、IAA、NAA 等， 后者包括 6-BA、ZT、KT等。不同植物激素在培養(yǎng)中的作用不同，生長素可以誘導細胞分裂和根的分化，而細胞分裂素則能促使細胞分裂和胚狀體的形成。蘇華等[17]在關(guān)于黃瓜花藥培養(yǎng)的研究中指出，對愈傷組織誘導率影響最大的是2，4-D。緱艷霞[5]在西瓜花藥培養(yǎng)中同樣發(fā)現(xiàn)，2，4-D在西瓜花藥愈傷組織誘導中起著關(guān)鍵作用，但其質(zhì)量濃度不宜超過0.5 mg/L。但也有學者指出在瓜類花藥愈傷組織的形成過程中，6-BA是一個關(guān)鍵因素。大量瓜類花藥培養(yǎng)試驗表明，在基本培養(yǎng)基中添加6-BA能顯著提高愈傷組織的誘導率，配合2，4-D 和 KT使用效果更好[22]。詹艷[12]在關(guān)于黃瓜小孢子培養(yǎng)的試驗中把2，4-D和6-BA配合使用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長春密刺、7447和康德三個黃瓜品種在2，4-D 0.5 mg/mL+6-BA 0.2 mg/mL的培養(yǎng)基上都誘導了胚胎的發(fā)生，長春密刺在無外源激素的培養(yǎng)基和濃度較高（2，4-D 1 mg/mL+6-BA 0.5 mg/mL 和 2，4-D 2 mg/mL+6-BA 1 mg/mL）的培養(yǎng)基上雖有胚狀體產(chǎn)生但產(chǎn)量顯著降低。此試驗說明外源激素是小孢子胚胎發(fā)生的必要條件，但是所需濃度較低。

2.4 活性炭

關(guān)于活性炭在小孢子培養(yǎng)中的作用，Weatherhead和Hensaw指出活性炭能吸附培養(yǎng)基中對小孢子生長發(fā)育有一定抑制作用的5-羥甲基糠醛、酚類物質(zhì)以及雜質(zhì)等，從而提高出胚率[23]。在十字花科、茄科以及禾本科的小孢子培養(yǎng)中使用活性炭提高小孢子出胚率的報道已經(jīng)很多，但是也有人指出活性炭在吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的同時也會吸附有益物質(zhì)如NAA、6-BA等，所以不同試驗材料效果可能有顯著差異。緱艷霞[5]和喻財鈴[24]分別在西瓜和絲瓜的花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)加入活性炭出胚效果差，有抑制愈傷組織形成的作用。

3 培養(yǎng)技術(shù)對小孢子胚胎發(fā)生的影響

小孢子的培養(yǎng)技術(shù)主要包括花蕾的低溫預處理和游離小孢子的高溫預培養(yǎng)，其目的主要是從形態(tài)上改變其極性分布，從生理代謝上改變其生理狀態(tài)，從而改變小孢子的發(fā)育途徑使其由配子體發(fā)育途徑向孢子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)變，對培養(yǎng)中能否出現(xiàn)胚狀體至關(guān)重要。

3.1 花蕾的預處理

在游離小孢子培養(yǎng)中預處理的方法很多，如低溫、高溫、熱激、離心以及甘露醇處理等，在葫蘆科中一般使用的預處理方法是低溫預處理，處理溫度為4℃。針對不同的作物處理的時間有所差別，魏瑛[25]指出，西瓜花藥在4℃處理72 h效果最佳；Ashok Kumar[26]等將黃瓜花蕾在4℃和32℃下分別處理1～10 d。結(jié)果表明，在4℃條件下處理2 d的效果最佳；董艷榮[6]的研究結(jié)果表明，甜瓜花藥在4℃條件下處理36 h效果最好；Metwally等[27]指出，南瓜在4℃的最佳預處理時間是4 d。但是也有報道指出，苦瓜愈傷組織的誘導率隨著在4℃預處理時間的延長而降低，預處理天數(shù)達到4 d時，愈傷組織的誘導率大幅降低[28]。

3.2 游離小孢子的預培養(yǎng)

游離小孢子在進行正常溫度（25～28℃）培養(yǎng)之前首先對其進行一段時間的高溫預培養(yǎng)是很有必要的，這在十字花科小孢子培養(yǎng)中已經(jīng)得到證實。高溫預培養(yǎng)的時間一般為24～48 h，處理溫度因植物種類不同而稍有差異（30～36℃）。有報道指出，與處于25℃恒溫條件下培養(yǎng)的小孢子相比，經(jīng)高溫預培養(yǎng)的小孢子在培養(yǎng)前3 d活力會有所降低，但是從第4天開始小孢子的活力顯著高于對照[29]。雖然高溫預處理在十字花科蔬菜游離小孢子培養(yǎng)中已經(jīng)得到了廣泛的應用，并且取得了很好的效果，但在葫蘆科蔬菜作物僅有緱艷霞[5]在西瓜的花藥培養(yǎng)中把花藥先在30℃條件下培養(yǎng)72 h然后轉(zhuǎn)到25℃條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)愈傷組織誘導率顯著提高。

3.3 接種密度對成胚率的影響

接種密度與成胚率表現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系，接種密度過大，小孢子在培養(yǎng)基中競爭養(yǎng)分和空間，不利于小孢子的生長；密度過小促進物質(zhì)無法形成，也不利于愈傷組織的形成。Duijs等[30]關(guān)于小孢子密度對培養(yǎng)效果的研究表明，當小孢子密度在2×104～4×104個/mL時最有利于胚狀體的形成。緱艷霞[5]在西瓜花藥培養(yǎng)中指出，通常在直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中接種4個花蕾的20枚花藥最為合適。

4 存在問題與進一步研究方向

雖然小孢子培養(yǎng)在育種及生物技術(shù)的運用等方面用處很大，但是關(guān)于小孢子培養(yǎng)技術(shù)的一些機制目前還不是很清楚，只是在十字花科、茄科及禾本科上得到了實際應用，在葫蘆科蔬菜上目前還停留在實驗室試驗階段。存在的主要問題是小孢子無法啟動萌發(fā)或者是成胚率太低、不同物種或不同基因型間差異較大、形成的愈傷組織或者是胚狀體無法進一步發(fā)育成為單倍體植株。在以后的研究中我們要從碳源、生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度、活性炭的應用、預培養(yǎng)的溫度以及時間幾個方面入手，爭取早日建立成熟的葫蘆科蔬菜小孢子培養(yǎng)的植株再生體系，從而使小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種以及其他生物技術(shù)的應用中發(fā)揮積極的作用。

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