崔 穎，王月田，姚 梅，胡 晶，李俊霞，王 宇，張 本

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧錦州121000)

創(chuàng)傷和疾病引起的頭頸部軟骨缺損的修復是耳鼻咽喉科頭頸外科醫(yī)師面臨的難題。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是源于中胚層的一類多能干細胞，是目前公認的理想的種子細胞。近年來的研究已證明轉(zhuǎn)化生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長分化因子等在誘導BMSCs向軟骨細胞分化的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但是目前有關(guān)選用何種生長調(diào)節(jié)因子以及如何保證其持續(xù)高效的刺激作用還處于探索階段。軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種多肽生長因子，具有特異的軟骨誘導能力，可在異位誘導形成軟骨。有關(guān)CDMP1對BMSCs誘導作用的研究多數(shù)是重組細胞因子的直接刺激作用，但細胞因子在體內(nèi)代謝快，持續(xù)時間短，誘導效率低，并且價格昂貴，使其應用受到一定的限制。隨著組織工程和基因工程的發(fā)展，細胞治療［1-4］和基因治療成為很有前途的治療方法。因此，通過基因工程技術(shù)將外源CDMP1基因?qū)隑MSCs，使其持續(xù)穩(wěn)定高效表達是解決上述問題的一種措施。本實驗將重組hCDMP1腺病毒感染的BMSCs與PLGA復合修復喉軟骨缺損，為基因工程化軟骨提供一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級1月齡新西蘭白兔［遼寧醫(yī)學院動物中心，SYXK(遼)2009-0004］。

1.2 主要試劑

DMEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、兔抗人CDMP1多克隆抗體及甲苯胺藍(Sigma公司)，病毒液Ad-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP和病毒液Ad-CMV-eGFP(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，胃蛋白酶(福州邁新生物科技開發(fā)公司)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(濟南岱罡公司)，Ⅱ型膠原蛋白多克隆抗體(上海優(yōu)寧維生物科技公司)，免疫組化試劑盒(北京博奧森公司)。

1.3 BMSCs的分離和培養(yǎng)

無菌條件下，取1月齡的健康新西蘭白兔股骨骨髓，100目篩網(wǎng)過濾，濾液轉(zhuǎn)入離心管，淋巴細胞分離液進行梯度離心［5］，取單核細胞層，無血清的L-DMEM洗滌細胞兩次，2%錐蟲藍染色，細胞計數(shù)，以4×105/mL的濃度接種于培養(yǎng)瓶中。48 h首次半換液，以后每隔2～3 d換液1次。

1.4 CDMP基因轉(zhuǎn)染BMSCs

取第3代兔BMSCs以5×105/孔的濃度接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后吸去上清。按照感染復數(shù)(MOI)=50、100、200和300四個值轉(zhuǎn)染BMSCs，留下2孔作為陰性對照。37℃孵育3 h，換成完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48～72 h，熒光倒置顯微鏡下檢測eGFP，以不引起明顯細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)的最大MOI作為腺病毒的最佳MOI值。取第3代生長狀態(tài)良好、生長至約80%匯合的BMSCs，隨機分為3組。轉(zhuǎn)染組:感染 Ad-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP(A組);未轉(zhuǎn)染組:感染Ad-CMV-eGFP(B組);對照組:未感染病毒(C組)。各組病毒液以最佳MOI值分別轉(zhuǎn)染BMSCs，48～72 h在熒光倒置顯微鏡下觀察感染效果，計算感染效率。

1.5 RT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)染后的CDMP1 mRNA表達

提取細胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RT-PCR檢測hCDMP1的表達。引物序列(表1)。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primer

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測CDMP1蛋白的表達

制備蛋白樣品，測定蛋白含量，據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，凝膠成像系統(tǒng)分析膜上目的條帶與內(nèi)參照。

1.7 免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞Ⅱ型膠原的表達

取感染后72 h的上述3組細胞爬片(每組10張)，丙酮固定。免疫組化方法檢測細胞Ⅱ型膠原的表達。醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定染色的吸光度。200倍鏡下切片隨機選取3個陽性視野測量吸光度，取其均值表示該標本的蛋白表達強度。

1.8 轉(zhuǎn)染細胞支架復合物修復軟骨缺損的動物實驗

新西蘭大白兔12只(3月齡，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg)，隨機分為3組。Ⅰ組:植入轉(zhuǎn)染組細胞與PLGA復合物;Ⅱ組:植入BMSCs與PLGA復合物;Ⅲ組:植入單純PLGA;每組4只。建立甲狀軟骨局部缺損的動物模型［6］，于左側(cè)做一1.0 cm ×1.0 cm全層軟骨缺損，不穿透喉黏膜。將上述3組細胞支架復合物移植缺損處，縫線稍做固定。術(shù)后每日耳緣靜脈注射青霉素160萬單位，連續(xù)應用3 d。術(shù)后觀察動物呼吸、活動及進食情況，分別于術(shù)后4和8周無痛處死動物，對所獲得的工程化軟骨進行大體和組織切片觀察。

1.9 統(tǒng)計學分析

應用SPSS17.0軟件對各組結(jié)果進行統(tǒng)計分析。數(shù)值以均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

BMSCs剛接種時，其內(nèi)有血細胞混雜，成分不易分辨。3 d后首次換液，可見貼壁細胞呈三角形、多角形或短梭形，部分區(qū)域有細胞的小集落形成，數(shù)個至數(shù)十個不等。6～7 d后貼壁的細胞體積增大，細胞形態(tài)基本一致，呈典型的成纖維細胞形態(tài)。10～12 d后貼壁的細胞逐漸增多并連接成片，呈魚群狀排列。傳代培養(yǎng)細胞比原代細胞成分純凈，2 d后大部分細胞貼壁，細胞形態(tài)較舒展，3～4 d可見細胞增殖，呈典型的長梭形，細胞數(shù)明顯增加，7～8 d長滿瓶底(圖1)。

2.2 感染后hCDMP1基因的表達

感染后24 h，A和B兩組細胞在熒光倒置顯微鏡下均可見到少量綠色熒光，48 h綠色熒光明顯增多，72 h則可見到大量綠色熒光，熒光與細胞輪廓一致，轉(zhuǎn)染率為90% 以上，持續(xù)14 d以上(圖2)，C組細胞未見綠色熒光。

2.3 RT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)染后的CDMP1 mRNA表達

A組出現(xiàn)約443 bp大小的電泳條帶，和hCDMP1 cDNA大小一致。而B組、C組均未出現(xiàn)電泳條帶(圖3)。

圖3 基因轉(zhuǎn)染后BMSCs中hCDMP1 mRNA的表達Fig 3 Expression of hCDMP1 mRNA of BMSCs after transfection by RT-PCR

圖4 感染后BMSCs中hCDMP1蛋白的表達Fig 4 Expression of hCDMP1 protein of BMSCs after transfection by Western blot

經(jīng)計算機圖像分析，各組Ⅱ型膠原表達(以積分吸光度IA表示)IA(表2)。

2.4 免疫印跡法(Western blot)檢測CDMP1蛋白的表達

轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)分子質(zhì)量大小約55.6 ku的明顯電泳條帶(與hCDMP1蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相符)，而未轉(zhuǎn)染組和對照組則無電泳條帶顯示(圖4)，內(nèi)參β-actin大小是43 ku。

2.5 免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞Ⅱ型膠原的表達

轉(zhuǎn)染組胞質(zhì)出現(xiàn)較明顯Ⅱ型膠原的表達;而未轉(zhuǎn)染組和對照組顯色較弱(圖5)。

表2 感染后BMSCs細胞外基質(zhì)染色的吸光度值(IA)Table 2 Analysis of IAD of BMSCs after transfection(n=10)

2.6 轉(zhuǎn)染細胞支架復合物修復軟骨缺損的動物實驗

所有動物術(shù)后4～8 h均可以進食，24 h后活動基本正常，頸部切口Ι期愈合。

圖5 感染后BMSCs中Ⅱ膠原蛋白的表達Fig 5 Expression of collagen typeⅡ of BMSCs after transfection by immunohischemistry(×200)

術(shù)后4周和8周分別處死每組動物，對軟骨缺損修復區(qū)進行觀察。術(shù)后4周可見Ⅰ組動物缺損處色澤淡紅，表面光滑，和周圍軟骨基本平齊。Ⅱ、Ⅲ組缺損處大體形態(tài)無明顯差異，創(chuàng)面明顯，色澤暗紅，與周圍正常軟骨界限清晰。缺損處充填組織質(zhì)地較軟，創(chuàng)面均未見明顯感染及壞死表現(xiàn)。術(shù)后8周見Ⅰ組動物缺損處創(chuàng)面稍顯灰白，呈現(xiàn)軟骨樣外觀，表面光滑，與正常軟骨邊界模糊。Ⅱ、Ⅲ組動物缺損處創(chuàng)面淡紅，凹陷，質(zhì)地較韌，與周圍正常軟骨界限清晰(圖6)。

對所獲得的組織工程化軟骨進行組織學觀察。4周時，缺損區(qū)未見明顯炎性反應。Ⅰ組動物頸部缺損區(qū)有不成熟的軟骨細胞生成，無明顯軟骨陷窩，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ、Ⅲ組動物頸部缺損區(qū)無明顯軟骨細胞生成，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陰性。8周時，Ⅰ組動物頸部缺損處軟骨樣細胞明顯增多，大量軟骨陷窩形成，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ、Ⅲ組動物缺損區(qū)基本為纖維瘢痕組織代替，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陰性(圖7，8，表3)。

表3 工程化軟骨GAG、Ⅱ型膠原陽性染色面積和吸光度分析Table 3 Analysis of GAG and collagenⅡpositive area and intensity of different groups(，n=10)

表3 工程化軟骨GAG、Ⅱ型膠原陽性染色面積和吸光度分析Table 3 Analysis of GAG and collagenⅡpositive area and intensity of different groups(，n=10)

*p＜0.05 compared with other groups.

group 4 weeks 8 weeks GAG Ⅰ 41.36±1.62* 85.75±1.93*5.09±0.49 5.53±0.32Ⅱ 7.57±0.42 8.67±0.52Ⅲ 6.71±0.48 7.31±0.61 collagenⅡ Ⅰ 37.99±2.39* 84.62±2.63*Ⅱ 6.01±0.44 6.38±0.25Ⅲ

3 討論

圖6 轉(zhuǎn)染細胞支架復合物移植后修復軟骨缺損的大體觀察Fig 6 The transfected and untransfected cell scaffold culture systems were implanted into the rabbit thyroid cartilage defects and the culturing systems were analyzed at the gross level

hCDMP1即生長分化因子5，是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的成員，也是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的新亞型［7-11］，在軟骨形成的初期主要是促進間充質(zhì)前軟骨細胞黏附、聚集和分化，后期則顯著促進軟骨細胞的成熟和肥大。目前國內(nèi)外已經(jīng)將CDMP1用于軟骨組織工程，但多數(shù)學者都是將CDMP1蛋白添加到體外研究體系中或注射到體內(nèi)進行實驗。雖然取得了較為可觀的結(jié)果，但是作用時間短、CDMP1蛋白的快速降解、反復追加致成本價格的昂貴以及反復干預的操作繁瑣限制了它的應用。通過將外源的CDMP1基因?qū)爰毎⑹蛊浞€(wěn)定表達的基因療法是解決以上問題的良方。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CDMP1基因?qū)胪霉撬杌|(zhì)干細胞，用以修復兔關(guān)節(jié)軟骨缺損。在用CDMP1轉(zhuǎn)染同源BMSCs植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處8周后，修復的軟骨表面形態(tài)可以與分化成熟的透明軟骨相比擬，而且軟骨下組織也完全由接近宿主軟骨下骨的新生厚層骨組織修復。用脂質(zhì)體介導法成功將hCDMP1基因轉(zhuǎn)染兔BMSCs并誘導成軟骨細胞，但所得工程化軟骨不及正常軟骨［1］。本實驗采用的腺病毒載體缺失E1區(qū)，即病毒復制缺失，故作為載體進行基因治療時不會在體內(nèi)不斷復制，也不會整合到宿主染色體內(nèi)，因而對于機體相對是安全的，但基因表達的可控性有待提高。本實驗采用腺病毒攜帶hCDMP1基因成功導入兔BMSCs，RT-PCR及Western blot等方法證實目的基因得到了穩(wěn)定表達，并持續(xù)2周以上，MTT檢測結(jié)果證明腺病毒攜帶hCDMP1基因感染BMSCs未引起B(yǎng)MSCs的過度增殖或抑制 (結(jié)果未在本文顯示)，說明腺病毒轉(zhuǎn)染相對是安全的，這為基因轉(zhuǎn)染應用于軟骨組織工程提供了依據(jù)。

PLGA具有良好的機械強度、生物相容性和可控制性［12］，廣泛應用于組織工程和藥物緩釋材料等方面。PLGA具有極高的生物相容性，安全性好，異物反應及免疫原性也極低，物理和化學性能穩(wěn)定，為BMSCs增殖和分化提供適宜的三維空間。

軟骨細胞間質(zhì)的化學成分主要包括膠原蛋白和蛋白多糖。軟骨組織中的膠原主要是Ⅱ型膠原，占膠原總量的90%以上。因此Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖是軟骨細胞的特殊標志。本實驗中，基因轉(zhuǎn)染后BMSCs合成細胞外基質(zhì)的能力增強，與對照組和未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖表達水平顯著提高，因此提示hCDMP1有誘導BMSCs向軟骨細胞表型分化的能力。動物實驗中觀察到4周時Ⅰ組動物頸部缺損區(qū)新生組織的Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ、Ⅲ組動物頸部缺損區(qū)上述染色陰性。8周時Ⅰ組缺損區(qū)類軟骨樣細胞增多，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性面積增多，Ⅱ、Ⅲ組缺損區(qū)為纖維組織修復，上述染色無明顯陽性。Ⅰ組Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖的分泌強于其他兩組，說明腺病毒攜帶hCDMP1基因感染BMSCs能使其持續(xù)表達具有生物學效應的hCDMP1。

本實驗采用腺病毒攜帶hCDMP1基因感染的BMSCs與PLGA復合修復喉軟骨缺損，從形態(tài)和組織學上分別證實了缺損區(qū)類軟骨的形成和喉軟骨缺損的成功修復。綜上所述，用轉(zhuǎn)染效率較高的腺病毒攜帶hCDMP1基因感染BMSCs，然后與PLGA三維生物支架結(jié)合所獲得的組織工程化軟骨可以有效地修復喉軟骨缺損。

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