湯海青，顧曉俊，殷居易，歐昌榮

(1.寧波出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，浙江寧波315012;2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211)

苯甲酸及其鈉鹽作為酸性防腐劑，在食品行業(yè)中廣泛使用。根據(jù)我國相關(guān)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)，苯甲酸及其鈉鹽可被限量用于多類食品，包括蜜餞涼果、腌漬蔬菜、調(diào)味料、果蔬汁等，而葡萄酒等產(chǎn)品不在允許添加之列［1］。但由于葡萄酒在自然發(fā)酵生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生一定量的苯甲酸成分，所以GB 15037－2006《葡萄酒》中對苯甲酸或苯甲酸納(以苯甲酸計)并未規(guī)定不得檢出，而是給出了允許檢出的最高限量值［2］。在葡萄酒中人工添加苯甲酸及其鈉鹽，可抑制酵母和霉菌的生長，對細(xì)菌的生長也有一定作用。因此，苯甲酸及其鈉鹽可能被非法使用于葡萄酒的防腐和保藏，如總糖較高、酒精度較低的一類保質(zhì)期相對較短的葡萄酒產(chǎn)品，特別應(yīng)注意苯甲酸在假冒偽劣葡萄酒中的濫用。為了對檢測結(jié)果進行準(zhǔn)確表達(dá)和有效評價，如實反映測量的置信度和準(zhǔn)確度，本文采用GB/T 5009.29－2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測定》中的第二法高效液相色譜法［3］，對一例苯甲酸含量在允許檢出的最高限量值50mg/L附近的樣品進行測定。并根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范JJF 1059－1999《測量不確定度評定與表示》的要求［4－5］，使用實驗室內(nèi)部確認(rèn)的數(shù)據(jù)計算不確定度。對葡萄酒中苯甲酸測量結(jié)果的不確定度進行分析，為評定測量結(jié)果提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品(1.00mg/mL) 中國計量科學(xué)研究院;甲醇(色譜純) 美國天地公司;其余試劑 均為分析純。

LC－30A高效液相色譜儀 日本島津公司;梅特勒XS204電子天平、梅特勒T50M自動電位滴定儀 瑞士梅特勒公司;JULABO SW22恒溫水浴 德國JULABO公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制 將苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品于室溫(20±4)℃平衡10min，搖動均勻，用移液管移取10mL至100mL容量瓶，得到濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。用移液器分別準(zhǔn)確吸取0.2、0.5、1.0、2.0mL至10mL容量瓶中定容，混勻后為2、5、10、20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確移取10.0mL葡萄酒樣品，放入燒杯中，水浴加熱除去乙醇，氨水(濃氨水∶水=1∶1)調(diào)pH約7.0，用超純水定容至25.0mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾。作為待檢測樣品，同時做空白對照。

1.2.3 試樣測定 按島津高效液相色譜操作規(guī)程規(guī)定的程序開機平衡系統(tǒng)，待基線穩(wěn)定后，取制備好的待測樣品液進樣分析，記錄色譜圖，用多點法峰面積校準(zhǔn)定量。色譜條件:色譜柱為Hyersil BDS C18柱，流動相為 0.02mol/L乙酸銨溶液/甲醇(85/15，V/V)，柱流速 1mL/min，進樣量10μL。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中苯甲酸含量計算公式如下:

式中，X為樣品中苯甲酸含量(mg/L);C為樣品苯甲酸濃度(μg/mL);V為樣品最終定容體積(mL);Vm為樣品體積(mL);F為稀釋因子。

上述計算公式是由測量原理得出的，沒有考慮各種隨機因素對不確定度的影響，在此應(yīng)引入反映隨機影響的重復(fù)性系數(shù)frep，其數(shù)值等于1。評定不確定度的數(shù)學(xué)模型應(yīng)寫成如下形式:

1.4 測量不定度來源

根據(jù)檢測過程和數(shù)學(xué)模型，不確定度的主要來源有:平行實驗重復(fù)性產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(frep);移取樣品體積產(chǎn)生的相對不確定度u(Vm);試樣前處理定容體積引起的相對不確定度u(V);標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引起的相對不確定度u(C);液相色譜儀定量重復(fù)性產(chǎn)生的相對不確定度u(LC)。相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度計算公式見式(3):

u(X)=［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1式(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 測量重復(fù)性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在重復(fù)條件下，對葡萄酒樣品進行7次測量，測量數(shù)據(jù)見表1。

表1 平行測量結(jié)果Table 1 Results of parallel determination

單次測量的實驗標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

在日常分析中，測定兩份樣品報告平均值，故平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

該測量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差是本測量所有隨機影響的合成，因此在隨后各分量的評定中無需再考慮隨機影響。

2.2 樣品移取體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Vm)

用10mL A級單標(biāo)線移液管移取樣品，按照計量檢定規(guī)程JJG 196－2006［6］，最大容量允差為0.020mL。按均勻分布(矩形分布)考慮，由此引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為實驗室的溫度在±4℃之間變動，考慮溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度。假設(shè)溫度變化時矩形分布，用水的膨脹系數(shù)(2.1×10－4/℃)計算，產(chǎn)生的體積變化引起的相對不確定度為合成得到樣品移取體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

2.3 定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本次實驗樣品定量總體積為25mL，采用25mL A級容量瓶定容，按照J(rèn)JG 196－2006，最大容量允差為±0.03mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為實驗室的溫度在±4℃之間變動，考慮溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度。假設(shè)溫度變化時矩形分布，產(chǎn)生的體積變化引起的相對不確定度為合成得到樣品移取體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

2.4 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.1 液體標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度 根據(jù)苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為1.00mg/mL，相對擴展不確定度為1%，包含因子k=2，因此其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C1)=0.005。

2.4.2 由苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C2) 將10mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液一次性全部轉(zhuǎn)移至100mL A級容量瓶，稀釋至濃度100μg/mL。再用微量可調(diào)移液器移取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液 200、500μL、1.0、2.0mL 至 10mL A 級容量瓶中并定容，配制成 2、5、10、20μg/mL 的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。產(chǎn)生的不確定度

按照J(rèn)JG 196－2006，100mL A級容量瓶的最大容量允差為±0.10mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為;考慮溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度0.00048。合成得到樣品移取體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

微量可調(diào)移液器允差±0.6%，按矩形分布，由此引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

10mL A級容量瓶的最大容量允差為±0.02mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。考慮溶液溫度與校正時溫度差引起的體積不確定度0.00048。合成得到樣品移取體積的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

上述不確定度互不相關(guān)，合成得:

2.4.3 校準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C3)制備4個苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液ci，每個濃度測定3次，得到4×3共12個峰面積—濃度值(cij，Aij)，測定結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)曲線Table 2 Calibration curve of standard solution

用最小二乘法擬合，截距a=3.0294×10－5，斜率b=0.02893，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 Aij=3.3 ×104cij－954.78。

實際測定中，對待測樣液測定2次(p=2)，響應(yīng)值分別為133792和134843，代入公式，求得預(yù)估濃度值 c=4.04μg/mL。

由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求c時產(chǎn)生的s(y)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.013。則標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度 s(Cp)為:

2.4.4 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度 將上述各不確定度分量合成得到苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.5 由高效液相色譜儀產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由校準(zhǔn)證書上可知，島津高效液相色譜儀的定量重復(fù)性誤差為1.0%，按均勻分布計算，則液相色譜儀的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.6 不確定度的合成

上述各項不確定度分量(見表3)互相獨立，葡萄酒樣品中苯甲酸的相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

u(X)=X［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1=0.49μg/mL

表3 不確定度分量Table 3 List of uncertainty components

2.7 擴展不確定度及結(jié)果

取包含因子k=2，置信水平約為95%，以全進法修約，計算擴展不確定度U(X)=0.49×2=0.98≈1mg/L。按 GB/T 5009.29－2003《食品中苯甲酸、山梨酸的測定》中的第二法規(guī)定的條件測定葡萄酒樣品中的苯甲酸(計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字)，測得平均值及其不確定度為(51±1)mg/L，包含因子k=2，置信水平約為95%。

3 結(jié)論

通過對測定苯甲酸過程中產(chǎn)生的不確定度進行量化，說明本實驗中高效液相色譜法測定葡萄酒樣品的苯甲酸含量過程中，由標(biāo)準(zhǔn)溶液和液相色譜儀引入的不確定度為主要來源，其次為測量重復(fù)性和移取樣品體積引入的不確定度。根據(jù)CNAS－GL27聲明檢測和校準(zhǔn)結(jié)果及與規(guī)范符合性指南［7］，當(dāng)測試結(jié)果高于上限或低于下限，而延伸擴展不確定度與上限或下限迭交時，則在95%的置信水平上不能聲明符合或是不符合標(biāo)準(zhǔn)。在置信水平低于95%的情況下，可能做出不符合規(guī)范的聲明。本實驗中結(jié)果值51mg/L高于規(guī)定上限值50mg/L，向下延伸不確定度后的結(jié)果值與上限值迭交，因此在95%的置信水平上不能聲明符合或是不符合標(biāo)準(zhǔn)。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB 2760－2011，食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［2］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB 15037－2006葡萄酒［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

［3］中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 5009.29－2003，食品中山梨酸、苯甲酸的測定［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

［4］國家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，JJF 1059－1999測量不確定度評定與表示［S］.北京:中國計量出版社，1999.

［5］中國合格評定國家認(rèn)可委員會，CNAS－GL 06化學(xué)分析中不確定度的評估指南［S］.北京:中國計量出版社，2006.

［6］國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，JJG 196－2006常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］.北京:中國計量出版社，2006.

［7］中國合格評定國家認(rèn)可委員會，CNAS－GL27聲明檢測和 校準(zhǔn)結(jié)果及與規(guī)范符合性指南［S］.北京:中國計量出版 社，2009.