李 時, 姜云壘, 劉 寶, 王海

張立世1, 張?zhí)炷?

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 長春 130118; 2. 東北師范大學(xué) 分子表觀遺傳學(xué)教育部重點實驗室, 長春 130024;3. 大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 遼寧 大連 116024)

鹀科(Emberizidae)隸屬于雀形目, 全世界共72屬321種, 我國分布6屬31種[1], 其中東北地區(qū)分布19種[2]. 由于鹀科鳥類間相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征, 因此, 研究人員對鹀科鳥類的分類和親緣關(guān)系等問題的研究目前仍存爭議[3-7].

Alst?rm等[7]研究表明, 葦鹀與蘆鹀間的親緣關(guān)系較近, 與紅頸葦鹀的親緣關(guān)系較遠(yuǎn); 梁剛等[8]利用CoⅠ基因(細(xì)胞色素c 氧化酶亞基Ⅰ)序列對這3種鹀進行的系統(tǒng)發(fā)育研究表明, 葦鹀與紅頸葦鹀比其和蘆鹀的親緣關(guān)系更近. 關(guān)于栗斑腹鹀與三道眉草鹀和白頭鹀間的親緣關(guān)系研究目前尚存爭議[9-10].

研究表明, 擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)在鹀屬種系發(fā)生及親緣關(guān)系中具有較高的物種區(qū)分能力, 可較好地區(qū)分不同物種或相同物種不同分布區(qū)內(nèi)的個體[11]. 因此, 本文選取蘆鹀、 葦鹀、 紅頸葦鹀、 栗斑腹鹀、 三道眉草鹀、 白頭鹀、 雪鹀和鐵爪鹀為研究對象, 以大山雀作為外群, 利用AFLP技術(shù)分析8種鹀的親緣關(guān)系及遺傳多樣性, 并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹, 為解決上述8種鹀的分類及親緣關(guān)系提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材 料

共使用33個樣本, 均為2007～2009年從野外采集成熟個體的肌肉樣, 代表了鹀科的8種鳥類, 并選擇大山雀作為外群. 樣本及其來源列于表1, 每個物種選取2個以上的個體作為實驗樣本. 樣本浸泡在無水乙醇中, 于-20 ℃保存.

表1 樣本及其來源

DNA提取所用蛋白酶K、 苯酚和氯仿均購自大連寶生物;AFLP引物和接頭均由上海生工生物合成;PCR擴增所需藥品試劑均購自上海生工生物； 采用美國MJResearch公司生產(chǎn)的MJResearchPTC-200和德國Biometra公司生產(chǎn)的T1型PCR擴增儀擴增; 采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-100型電泳儀進行電泳檢測.

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA提取 采用蛋白酶K消化、 酚-氯仿抽提、 無水乙醇沉淀的方法提取基因組DNA[12], 用瓊脂糖凝膠電泳法測定DNA分子量約為50 000, 且膠孔不發(fā)亮,DNA主帶清晰, 無彌散帶,RNA去除干凈,DNA純度較高, 符合AFLP技術(shù)要求, 如圖1所示. 將提取的DNA溶液稀釋10倍后, 通過比較DNA主帶與λDNAMarker(10ng/μL)間的亮度估測樣本DNA的質(zhì)量濃度, 提取后的DNA加超純水稀釋至100ng/μL, 于-20 ℃保存.

1.2.2AFLP分析 采用AFLP技術(shù)[13]優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件.

1.2.2.1 基因組DNA的酶切和接頭連接 取300ng基因組DNA, 用EcoRⅠ和Mse Ⅰ進行雙酶切, 酶切片段與EcoRⅠ和MseⅠ接頭連接, 反應(yīng)體系為20μL: 300ng基因組DNA, 2.0μL10×T4連接緩沖液, 1μgBSA, 2.5pmolEcoRⅠ接頭, 50pmolMse Ⅰ接頭, 50.01nkatEcoRⅠ酶, 50.01nkatMse Ⅰ酶, 8.335nkatT4連接酶, 加超純水至20μL. 酶切連接時間為8h, 其中37 ℃酶切4h, 8 ℃連接4h. 酶切連接所用接頭見表2.

M為λDNA Marker.圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 DNA agsrose electrophoresis

表2 連接所用的接頭

1.2.2.2 限制性片段的擴增 采用3′端帶有1個選擇性堿基的引物組(EcoR Ⅰ+A/MseⅠ+C)預(yù)擴增限制性片段, 反應(yīng)體系為25 μL: 2 μL連接產(chǎn)物, 2.5 μL 10×PCR緩沖溶液, 2.5 mmol dNTP, 30 ngEcoR Ⅰ+A, 30 ngMseⅠ+C, 16.67 nkat Taq酶, 加超純水至25 μL. PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃ 45 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 80 s, 共29個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min.EcoR Ⅰ+A的引物序列為5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′；MseⅠ+C的引物序列為5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′. 選擇性擴增引物帶有3個選擇性堿基, 從64對引物中篩選9對條帶清晰且多態(tài)性較好的引物組合進行選擇性擴增, 分別為M-CAT/E-ACT,M-CAT/E-ACC,M-CTA/E-ACC,M-CTA/E-ACT,M-CTC/E-ACC,M-CTG/E-ACT,M-CTG/E-ACC,M-CTT/E-ACT和M-CTT/E-ACC. 選擇性擴增的反應(yīng)體系為15 μL： 20倍稀釋的預(yù)擴增限制性片段產(chǎn)物2 μL, 1.5 mmol dNTP, 1.5 μL 10×PCR緩沖溶液, 3 ngEcoR Ⅰ, 18 ngMseⅠ, 8.335 nkat Taq酶, 加超純水至15 μL. PCR反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性2 min； 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 80 s, 每個循環(huán)退火溫度降低1 ℃； 9個循環(huán)后, 再進行34個循環(huán)擴增, 條件為94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 80 s; 72 ℃延伸10 min.

1.2.2.3 電泳檢測 取15 μL選擇性擴增產(chǎn)物, 加7 μL 3×上樣緩沖液, 上樣于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的聚丙烯酰胺變性膠上進行電泳, 緩沖液為1×TBE, 電泳條件為： 55 W恒定功率, 電泳3 h. 用銀染方法顯示AFLP譜帶, 如圖2所示.

(A) M-CAT/E-ACT(B) M-CTG/E-ACT圖2 引物組合擴增的AFLP指紋譜Fig.2 AFLP fingerprinting amplified with primer

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 每條擴增條帶記為一個分子標(biāo)記, 每兩個樣品間的分子標(biāo)記進行比對, 當(dāng)位點有擴增條帶時賦值為1, 否則賦值為0, 僅統(tǒng)計清晰的擴增條帶, 將整個AFLP擴增譜轉(zhuǎn)化成“1”和“0”的信息矩陣. 利用NTSYSpc-2.10e軟件提供的Jaccard系數(shù)計算不同物種間的相似性系數(shù)：

式中:NAB為兩個個體的共有條帶數(shù);NA和NB分別為個體A和B的條帶數(shù).

括號中的數(shù)字代表該鳥的樣本編號.圖3 8種鹀的UPGMA聚類樹Fig.3 UPGMA tree of 8 buntings

2 結(jié) 果

利用改良后的AFLP方法研究從64對引物中篩選9對多態(tài)性較好的鹀科3屬8種鳥類的親緣關(guān)系, 共得到438條清晰條帶, 其中鹀科內(nèi)多態(tài)性條帶為316, 占72.1%； 屬內(nèi)多態(tài)性條帶為239, 占54.6%； 栗斑腹鹀、 三道眉草鹀和白頭鹀的多態(tài)性條帶為190, 占43.4%； 蘆鹀、 葦鹀和紅頸葦鹀的多態(tài)性條帶為35, 占8.0%.

本文以大山雀作為外群, 利用NTSYSpc-2.10e軟件構(gòu)建了8種鹀的UPGMA系統(tǒng)進化樹, 如圖3所示. 由圖3可見, 8種鹀分為兩類, 其中A類包括所有鹀屬鳥類, B類包括鐵爪鹀屬的鐵爪鹀和雪鹀屬的雪鹀, 所選的外群大山雀為一類, 其與鹀科鳥類間的相似性系數(shù)僅為0.272 6.

在A進化支中可分為兩支, 一支包括栗斑腹鹀、 三道眉草鹀和白頭鹀, 其中栗斑腹鹀和三道眉草鹀間的親緣關(guān)系較近, 相似性系數(shù)為0.779 7, 二者與白頭鹀間的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn), 相似性系數(shù)為0.637 8. 另一分支包括蘆鹀、 葦鹀和紅頸葦鹀, 其中葦鹀和紅頸葦鹀間的親緣關(guān)系較近, 相似性系數(shù)為0.952 1, 與蘆鹀間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 相似性系數(shù)為0.883 0. 兩支間的相似性系數(shù)為0.449 5.

在B類中, 鐵爪鹀和雪鹀為一支, 二者的相似性系數(shù)為0.568 2, B進化支與A進化支間的相似性系數(shù)為0.460 0.

3 討 論

3.1 鹀屬親緣關(guān)系和遺傳多樣性

由于栗斑腹鹀分布范圍狹窄, 且身體和頭部羽色與三道眉草鹀和白頭鹀相似, 并與三道眉草鹀的繁殖分布區(qū)相互重疊. 因此, 文獻[9]認(rèn)為栗斑腹鹀為三道眉草鹀和白頭鹀的雜交種. 文獻[10]研究栗斑腹鹀的分布及其繁殖習(xí)性表明, 白頭鹀并未在栗斑腹鹀繁殖區(qū)內(nèi)出現(xiàn), 認(rèn)為栗斑腹鹀不一定為三道眉草鹀與白頭鹀的雜交種. 本文研究表明, 栗斑腹鹀與三道眉草鹀和白頭鹀為同一支系, 且與三道眉草鹀的親緣關(guān)系較近, 與白頭鹀和其他鹀屬鳥類親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 該結(jié)果與文獻[7-8]的研究結(jié)果基本一致, 但并不能證明栗斑腹鹀為三道眉草鹀和白頭鹀的雜交種.

在鹀屬的另一進化支中, 葦鹀與紅頸葦鹀的相似性系數(shù)為0.952 1, 又與蘆鹀的相似性系數(shù)為0.883 0, 表明葦鹀與紅頸葦鹀的親緣關(guān)系較近, 與蘆鹀的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn). 其中栗斑腹鹀與三道眉草鹀和白頭鹀間的多態(tài)性條帶較多, 蘆鹀、 葦鹀和紅頸葦鹀間的多態(tài)性條帶較少, 表明其具有較低的遺傳多樣性.

3.2 鐵爪鹀和雪鹀

本文將鐵爪鹀和雪鹀從鹀屬中分離, 單獨分為一個進化支, 與鹀屬間的相似性系數(shù)僅為0.460 0, 與文獻[13-14]研究結(jié)果相符.

[1] 鄭光美. 世界鳥類分類與分布名錄 [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2002: 232-239.

[2] 高瑋. 中國東北地區(qū)鳥類及其生態(tài)學(xué)研究 [M]. 北京: 科學(xué)出版社, 2006: 272-282.

[3] Paynter R A, Storer R W. Subfamily Emberizinae, Buntings and American Sparrows [C]//Paynter R A, Jr. Check-List of Birds of the World. Vol.13 Mus Comp Zool. Cambridge: MA, 1970: 3-214.

[4] Avise J C, Patton J C, Aquadro C F. Evolutionary Genetics of Birds Ⅱ. Conservative Protein Evolution in North American Sparrows and Relatives [J]. Syst Biol, 1980, 29(4): 323-334.

[5] Yuri T, Mindell D P. Molecular Phylogenetic Analysis of Fringillidae, “New World Nine-Primaried Oscines” (Aves: Passeriformes) [J]. Mol Phylogenet Evol, 2002, 23(2): 229-243.

[6] Ericson P G P, Johansson U S. Phylogeny of Passerida (Aves: Passeriformes) Based on Nuclear and Mitochondrial Sequence Data [J]. Mol Phylogenet Evol, 2003, 29(1): 126-138.

[7] Alst?rm P, Olsson U, Lei F M, et al. Phylogeny and Classification of the Old World Emberizini (Aves, Passeriformes) [J]. Mol Phylogenet Evol, 2007, 47(3): 960-973.

[8] LIANG Gang, LI Tao, YIN Zuo-hua, et al. Molecular Phylogenetic Analysis of Some Fringillidae Species Based on Mitochondrial CoⅠ Gene Sequences [J]. Zoological Research, 2008, 29(5)： 465-475. (梁剛, 李濤, 尹祚華, 等. 利用CoⅠ基因序列對雀科鳥類的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系初探 [J]. 動物學(xué)研究, 2008, 29(5)： 465-475.)

[9] Yamashina Y. Notes onEmberizajankowskiiTaczanowski with Special Reference to Its Speciation [J]. J Fac Sci Hokkaido Univ Ser Ⅵ: Zool, 1957, 13: 164-171.

[10] FU Tong-sheng, CHEN Peng. The Distribution and Breeding Habits ofEmberizajankowskii[J]. Acta Zool Sin, 1966, 18(2): 195-198. (傅桐生, 陳鵬. 栗斑腹鹀的分布及其繁殖習(xí)性 [J]. 動物學(xué)報, 1966, 18(2): 195-198.)

[11] JIANG Yun-lei, LI Shi, WANG Hai-tao, et al. AFLP Markers Analysis of Genetic Diversity inEmberiza[J]. Journal of Jilin University: Science Edition, 2007, 45(4): 686-690. (姜云壘, 李時, 王海濤, 等. AFLP分子標(biāo)記在鹀屬遺傳多樣性分析中的初探 [J]. 吉林大學(xué)學(xué)報: 理學(xué)版, 2007, 45(4): 686-690.)

[12] YAN Fei-huan, ZUO Zheng-hong, CHEN Mei, et al. Analysis of Genetic Diversity and Relationship among Some Chinese Domestic Ducks and Wild Ducks Using AFLP [J]. Journal of Xiamen University: Natural Science, 2005, 44(5): 729-733. (鄢緋寰, 左正宏, 陳美, 等. 我國部分家鴨和野鴨遺傳多樣性及親緣關(guān)系的AFLP分析 [J]. 廈門大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2005, 44(5): 729-733.)

[13] Vos P, Hogers R, Bleeker M, et al. AFLP a New Technique for DNA Fingerprinting [J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(21): 4407-4414.

[14] Tordoff H B. Relationships in the New World Nine-Primaried Oscines [J]. The Auk, 1954, 71(3): 273-284.