張昌壯, 張培旭, 姚 華, 楊 潔, 金永日, 李緒文, 李清民

(1. 吉林大學(xué) 化學(xué)學(xué)院, 長(zhǎng)春 130012； 2. 吉林省煙草產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站, 長(zhǎng)春 130062；3. 吉林大學(xué) 藥學(xué)院, 長(zhǎng)春 130021)

木蝴蝶為紫葳科植物木蝴蝶(Oroxylumindicum(L.)Vent)的成熟種子, 具有止咳、 抗炎、 抗菌和抗氧化等作用, 其主要化學(xué)成分為黃酮及其苷類, 并含有對(duì)羥基苯乙醇和環(huán)己醇類化合物以及揮發(fā)油類化合物等[1]. 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B為木蝴蝶中的主要成分[2], 2010版《中國(guó)藥典》增加了使用薄層色譜法的鑒別項(xiàng), 對(duì)照品為木蝴蝶苷B和黃芩苷[3]. 文獻(xiàn)[4]定量分析了木蝴蝶中非特征性成分黃芩苷; 文獻(xiàn)[5]采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定了木蝴蝶中黃芩素和白楊黃素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)； 文獻(xiàn)[6]采用HPLC法測(cè)定了木蝴蝶苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù); 文獻(xiàn)[7]采用HPLC法測(cè)定了木蝴蝶提取物中木蝴蝶苷A的質(zhì)量分?jǐn)?shù); 文獻(xiàn)[8]采用HPLC法, 通過(guò)梯度洗脫同時(shí)測(cè)定了木蝴蝶中13種化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù). 本文使用一種簡(jiǎn)便的HPLC方法, 測(cè)定木蝴蝶中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

木蝴蝶購(gòu)自安徽亳州和河北安國(guó)等地, 經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)鄧明魯教授鑒定為Oroxylumindicum(L.)Vent.的干燥種子； 實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水; 甲醇為色譜純; 磷酸為分析純； 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B單體均從木蝴蝶中提取分離得到, 其結(jié)構(gòu)經(jīng)核磁共振光譜鑒定, 經(jīng)HPLC歸一化法測(cè)得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100.0%和99.12%.

1.2 主要儀器

Agilent1200型系列高效液相色譜儀配紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司); Mettlertoledo AG135型電子天平(德國(guó)Startorius公司); 加熱回流裝置和RE-201C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠); KQ-250B超聲波發(fā)生器(昆山市超聲波儀器有限公司).

1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取適量對(duì)照品木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B, 加甲醇制成每1 mL含木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B各0.1 mg的混合溶液.

1.4 供試品溶液的制備

稱取0.200 g藥材粉末(過(guò)100目篩), 用15 mL體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇回流提取2次, 回流時(shí)間分別為1 h和0.5 h, 合并提取液并蒸干, 加甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中, 搖勻, 取上清液, 過(guò)0.2 μm微孔濾膜, 取續(xù)濾液.

1.5 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)

色譜柱為COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm, 5 μm)； 柱溫25.0 ℃； 流動(dòng)相V(甲醇)∶V(φ(磷酸)=0.2%)=4∶6； 流速為1.0 mL/min； 波長(zhǎng)為278 nm； 進(jìn)樣量20 μL. 將對(duì)照品溶液和供試品溶液各20 μL置于高效液相色譜儀分析測(cè)定, 其色譜圖如圖1所示. 在本實(shí)驗(yàn)條件下, 化合物木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的理論塔板數(shù)分別為3 800和6 500, 分離度分別為2.91和6.43.

圖1 化合物木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)和樣品(B)的HPLC色譜Fig.1 HPLC charomatograms of Oroxin A and Oroxin B of reference substances (A) and sample (B)

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 線性關(guān)系考察

精密稱取適量木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B, 加甲醇配制成質(zhì)量濃度均為0.100 mg/mL的混標(biāo)溶液. 將該標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋, 制得質(zhì)量濃度分別為50.0,25.0,10.0,5.00,2.50 μg/mL的混標(biāo)溶液. 分別取上述標(biāo)準(zhǔn)液各20 μL, 注入液相色譜儀, 考察峰面積對(duì)進(jìn)樣量的線性范圍. 若以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo), 峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 則木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的回歸方程分別為Y=2 978.8X-21.931(r2=0.999 9)和Y=2 371.9X-10.88(r2=0.999 9), 兩者線性范圍均為0.050～2.0 μg.

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

量取質(zhì)量濃度均為10.0 μg/mL的木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的混合溶液20 μL, 連續(xù)進(jìn)樣6次, 測(cè)得峰面積, 記錄保留時(shí)間, 計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD), 考察日內(nèi)精密度. 結(jié)果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B峰面積的RSD分別為1.47%和0.76%, 保留時(shí)間的RSD分別為0.10%和0.09%； 將該溶液連續(xù)6 d, 每天進(jìn)樣一針, 測(cè)得峰面積, 記錄保留時(shí)間, 計(jì)算RSD, 考察日間精密度. 結(jié)果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B峰面積的RSD分別為0.85%和0.98%, 保留時(shí)間的RSD分別為0.33%和0.28%.

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)樣品粉末, 按1.4方法制備供試品溶液, 分別于0,2,4,8,16,24 h按上述色譜條件進(jìn)樣分析. 結(jié)果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B峰面積的RSD分別為0.43%和0.28%, 保留時(shí)間的RSD分別為0.48%和0.34%. 因此, 供試品溶液在24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性較好.

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取1號(hào)樣品粉末6份, 按1.4方法制備供試品溶液, 按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定. 結(jié)果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)(n=6)分別為4.17%和3.57%, RSD分別為0.42%和0.76%.

2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別稱取6份已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1號(hào)粉末樣品、 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B對(duì)照品各100.0,4.10,3.60 mg, 按1.4方法制備供試品溶液, 按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定, 計(jì)算回收率. 結(jié)果表明, 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的平均回收率(n=6)分別為101.14%和100.41%, RSD分別為1.07%和2.26%.

2.6 檢測(cè)限與定量限

稱取木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B各10.0 mg, 置于100 mL容量瓶中, 加甲醇溶解并定容, 稀釋,得到兩種對(duì)照品質(zhì)量濃度均為1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 并用色譜儀記錄其峰高, 計(jì)算信噪比. 測(cè)得木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的定量限為5 ng, 檢測(cè)限為2 ng.

2.7 樣品測(cè)定

將12個(gè)批次的木蝴蝶樣品制成供試品溶液進(jìn)行測(cè)定, 計(jì)算樣品中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù), 其中: 1～3號(hào)樣品購(gòu)于安徽亳州; 4～6號(hào)樣品購(gòu)于河北安國(guó); 7和8號(hào)樣品購(gòu)于廣東廣州; 9號(hào)樣品購(gòu)于廣東江門; 10和11號(hào)樣品購(gòu)于廣西龍州; 12號(hào)樣品購(gòu)于貴州安順. 樣品測(cè)定結(jié)果列于表1.

表1 12種木蝴蝶樣品中木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 討 論

3.1 色譜條件選擇

本文考察了COSMOSIL-C18-MS-Ⅱ(4.6 mm×250 mm, 5 μm)和Agilent ZORBAX-SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)兩種色譜柱, 結(jié)果表明: 后者在選定的各種流動(dòng)相條件下木蝴蝶苷A的分離度均小于1.5, 前者可有效分離木蝴蝶苷A; 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B在波長(zhǎng)215,278,314 nm處均有較強(qiáng)吸, 在278 nm處吸收最強(qiáng), 且節(jié)省紫外燈能量, 因此選定278 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng). 將V(甲醇)∶V(φ(冰醋酸)=1%)=38∶62,V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(φ(冰醋酸)=1%)=20∶20∶60,V(甲醇)∶V(φ(磷酸)=0.2%)=42∶58作為流動(dòng)相的分析效果, 結(jié)果表明,V(甲醇)∶V(φ(磷酸)=0.2%)=42∶58 作為流動(dòng)相可達(dá)到基線分離, 且分析時(shí)間較短.

3.2 對(duì)照品溶液與供試品溶液制備

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 木蝴蝶苷B在水中溶解度大, 但其水溶液不穩(wěn)定, 放置一段時(shí)間后色譜峰分裂為2個(gè); 木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B均溶解于甲醇, 且其溶液穩(wěn)定, 因此選擇甲醇作為配制對(duì)照品溶液的溶劑. 在供試品溶液制備過(guò)程中, 考察了超聲、 冷浸和加熱回流等方法, 比較了乙酸乙酯、 乙醇、 體積分?jǐn)?shù)分別為85%,70%,55%的甲醇的提取效果, 并考察了回流提取次數(shù). 結(jié)果表明: 加熱回流的提取方法效果最佳； 體積分?jǐn)?shù)為85%的甲醇提取量最高, 15 mL溶劑回流提取2次即可將木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B完全提取.

3.3 質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

在不同產(chǎn)地的12個(gè)批次木蝴蝶樣品中, 由于木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于3.00%, 因此均可作為木蝴蝶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定指標(biāo).

綜上所述, 本文方法可同時(shí)測(cè)定木蝴蝶苷A和木蝴蝶苷B的質(zhì)量分?jǐn)?shù), 方法簡(jiǎn)便, 結(jié)果可靠, 可作為木蝴蝶質(zhì)量控制的參考依據(jù).

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