胡文舉，宋艷畫，吳伶俐

（1.河南廣播電視大學(xué)，河南鄭州黃河路124號(hào)450008；2.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南中牟 451450）

雞大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一組雞的傳染病，是目前危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一。雞致病性大腸桿菌血清型復(fù)雜，變異迅速，耐藥菌株不斷地出現(xiàn)，使該病的防治十分困難。黃連素是黃連水提物的主要成分，對(duì)多種致病性細(xì)菌有不同程度的抑制作用，同時(shí)其具有不易產(chǎn)生耐藥性、毒副作用小、藥物殘留低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于胃腸道細(xì)菌性感染的治療[1]。黃芪多糖是具有較強(qiáng)免疫活性的一類物質(zhì)，具有促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抑菌等生物活性，作為免疫增強(qiáng)劑被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)禽業(yè)中[2]。本文通過黃連素和黃芪多糖聯(lián)合用藥對(duì)雞致病性大腸桿菌體外抑菌作用研究，評(píng)價(jià)其聯(lián)合用藥效果，為臨床上二者聯(lián)合使用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品 黃連素（純度99%）、黃芪多糖（純度80%）購(gòu)自鄭州市賀鑫生物技術(shù)有限公司；LB肉湯干粉培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司。其余試驗(yàn)藥品均購(gòu)自鄭州市醫(yī)藥市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)菌株：雞源大腸桿菌（C83845）購(gòu)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所；臨床分離菌株（致病性大腸桿菌菌株3株）由鄭州市某養(yǎng)殖場(chǎng)中采集病料，并進(jìn)行分離、鑒定。

1.3 培養(yǎng)基制備 供試菌種培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基。LB肉湯液體培養(yǎng)基和LB瓊脂培養(yǎng)基均按照產(chǎn)品使用說明書配制。LB肉湯液體培養(yǎng)基配制完成后高壓蒸汽滅菌，密封保存?zhèn)溆?；LB瓊脂培養(yǎng)基配制完成，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中制成5mm厚培養(yǎng)板備用。

1.4 藥液配制 精密稱取黃連素和黃芪多糖（均折合成實(shí)際含量），用滅菌蒸餾水分別配制成8mg/mL和160mg/mL濃度的藥液。藥液配制完成后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，待藥液冷卻后在無菌條件下分裝于滅菌的EP管中，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌液的制備 用接種環(huán)蘸取菌株，加入含有一定量LB肉湯培養(yǎng)液的帶塞試管中，做好標(biāo)記，置于生化培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)18h；用接種環(huán)蘸取菌液，劃線接種于含有LB瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于生化培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)18h；用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于2.0mLLB肉湯培養(yǎng)液中，置于生化培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)6h，用生理鹽水以10倍稀釋法依次進(jìn)行稀釋，選取適當(dāng)濃度的菌液0.1mL，置于含有LB瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用無菌接種環(huán)涂抹均勻，置于生化培養(yǎng)箱中37℃條件下培養(yǎng)18h，計(jì)算菌落數(shù)。根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算稀釋倍數(shù)，用生理鹽水將菌落稀釋至2×105CFU/mL后備用[3]。

1.6 單藥MIC測(cè)定 用試管采取倍比稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（MIC），藥物抑制大腸桿菌生長(zhǎng)的最小濃度為最小抑菌濃度。取12支試管，每管加入1.0mLLB肉湯培養(yǎng)液，再在第一管中加入1.0mL配置好的藥物原液（根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果選擇藥物濃度），充分混合均勻后取出1.0mL放入第2管，充分混合均勻后取出1.0mL放入第3管，依此類推，直至第10管，第11管作陽(yáng)性對(duì)照，第12管做陰性對(duì)照。完成后除第12管外其余每管加入1.0mL菌液，使菌液的濃度為1×105CFU/mL。將所有試管置于生化培養(yǎng)箱中，37℃條件下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。輕搖試管見絮狀渾濁者為抑菌陰性，澄清者為陽(yáng)性。呈陽(yáng)性所含的最低藥物濃度即為MIC[4]。整個(gè)過程重復(fù)操作2次，最終所測(cè)藥物MIC值取2次平均值。

1.7 聯(lián)合藥敏試驗(yàn) 將黃連素和黃芪多糖用LB肉湯培養(yǎng)液倍比稀釋，按棋盤法設(shè)計(jì)，兩兩組合加入一次性96孔板上。藥物采用6個(gè)稀釋梯度，最高濃度為其單藥MIC的2倍，依次倍比稀釋。藥物按濃度各取50μL按縱列和橫列進(jìn)行各濃度兩兩聯(lián)合，完成后每孔再加入100μL菌液，使菌液的濃度為1×105CFU/mL。將96孔板置于生化培養(yǎng)箱中，37℃條件下培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果。大腸桿菌生長(zhǎng)指標(biāo)同單藥藥敏試驗(yàn)。無菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為聯(lián)用時(shí)藥物的MIC[5]。

1.8 結(jié)果判定 以部分抑菌濃度指數(shù)FIC作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)。FIC≤0.5表示有協(xié)同作用，0.5

FIC=（甲藥聯(lián)用 MIC/甲藥單用 MIC）+（乙藥聯(lián)用MIC/乙藥單用MIC）

2 結(jié)果

2.1 單藥的抑菌作用 黃連素和黃芪多糖單用對(duì)大腸桿菌的MIC見表1。由表1可見，單獨(dú)使用黃連素對(duì)各菌株的MIC變化范圍比較大，說明各菌株對(duì)黃連素敏感性差異較大。單獨(dú)使用黃芪多糖對(duì)各菌株的MIC為10mg/mL～15mg/mL。

2.2 聯(lián)合用藥的抑菌作用 見表1。由表1可知，黃連素和黃芪多糖聯(lián)合使用對(duì)雞源大腸桿菌的平均FIC為0.91，說明兩者藥物對(duì)雞源大腸桿菌抑菌作用整體上呈相加作用，但對(duì)于臨床菌株3兩者呈無關(guān)作用。

3 討論

本研究結(jié)果表明，黃連素對(duì)4株雞源大腸桿菌MIC最低為0.375mg/mL，最高為1.0mg/mL。張濤等研究表明，黃連素對(duì)大腸桿菌體外MIC為1.0mg/mL[6]。劉玉慶等的研究結(jié)果為2.5mg/mL[7]。造成各研究結(jié)果之間差異較大的原因可能是供試菌株不同。這提示黃連素對(duì)大腸桿菌的體外抑菌效果因菌株不同而存在差異。

對(duì)于黃芪多糖的體外抑菌作用，楊玉艾等的研究認(rèn)為，黃芪多糖在體外對(duì)鏈球菌、大腸桿菌和金黃葡萄球菌均有一定的抑菌作用，且抑菌作用與濃度呈正相關(guān)，其對(duì)大腸桿菌有效抑菌濃度為6.6mg/ml[2]。本研究得到了與其相似的結(jié)果。劉永錄等研究也認(rèn)為黃芪多糖有一定的抑菌作用，但其認(rèn)為在20mg/ml條件下抑菌效果最好[8]。這與楊玉艾及本研究結(jié)果有較大差異。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，黃芪多糖對(duì)雞源大腸桿菌的MIC為10～15mg/mL。這提示黃芪多糖在體外有一定的抑菌效果，但效果較弱，說明黃芪多糖在體內(nèi)對(duì)大腸桿菌的抑菌作用可能是通過其他途徑實(shí)現(xiàn)的。

表1 黃連素和黃芪多糖單用及聯(lián)合對(duì)雞源大腸桿菌的MIC和FIC

本實(shí)驗(yàn)采取棋盤法進(jìn)行了黃連素和黃芪多糖對(duì)4株雞源大腸桿菌的體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種藥物聯(lián)合使用在3株菌株中呈現(xiàn)相加作用，1株菌株呈現(xiàn)無關(guān)作用。通過聯(lián)合用藥，使黃連素的抗菌活性提高了2～8倍，黃芪多糖的抗菌活性提高了1～2倍。說明在有效抑菌的基礎(chǔ)上，兩者聯(lián)合用藥能夠大大減少藥物的使用量。本研究結(jié)果為臨床上兩藥聯(lián)合使用治療雞源大腸桿菌病提供了理論依據(jù)。

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