劉麗榮， 李 霜， 王圓圓， 石明雋， 肖 瑛， 郭 兵△

(貴陽醫(yī)學院1醫(yī)學檢驗學院臨床生化教研室，2基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學教研室，貴州貴陽550004)

在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)展過程中，腎組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)表達顯著上調(diào)，主要通過激活Smads信號通路，誘導腎小管上皮細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促使細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成增加并抑制其降解而過度沉積，從而造成廣泛的腎組織纖維化［1-2］。Smad7作為抑制性Smad蛋白，可以抑制 TGF-β1/Smads介導的生物學效應(yīng)，在多種腎纖維化疾病過程中，Smad7的蛋白表達顯著下調(diào)［3］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿(oxymatrine，OM)具有抗肝纖維化［4-5］、肺纖維化［6］、皮膚瘢痕纖維化［7］等作用，但對DN腎小管間質(zhì)纖維化是否有此作用且作用機制方面的研究通過廣泛查閱資料未見報道。因此，本研究旨在觀察高糖條件下OM對大鼠近端腎小管上皮NRK52E細胞TGF-β1及其信號通路的重要負調(diào)控因子Smad7表達變化的影響，探討OM對高糖誘導的大鼠腎小管EMT的作用及其可能機制，為OM應(yīng)用于DN治療提供重要的理論和實驗依據(jù)。

材料和方法

1 細胞

大鼠近端腎小管上皮NRK52E細胞由復旦大學陸利民教授惠贈。

2 主要試劑

胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基(HyClone);胎牛血清(Gibco)，甲叉丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺(Ameresco);抗 TGF-β1、抗 Smad7、抗 α-SMA 和抗 E-cadherin(Santa Cruz);抗 β-actin、DAB、辣根過氧化物酶標記羊抗兔和羊抗小鼠IgG(博士德);總RNA提取試劑盒和蛋白質(zhì)marker(天根);BCA蛋白濃度測定試劑盒、MMT細胞增殖及毒性檢測試劑盒(碧云天);PVDF膜、Whatman濾紙(Millinpore Mass);RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas);ECL顯色劑(Pierce);Real-time PCR MasterMix(SYBR Green)(Bio-Rad);real-time PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計合成，見表1;氧化苦參堿(中國藥品生物制品檢定所，批號為110780-201007)。

表1 引物序列Table 1．Sequences of the primers

3 主要方法

3．1 細胞培養(yǎng)與分組 復蘇NRK52E細胞，于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2恒溫條件下培養(yǎng)。待細胞生長達80%融合時，換無血清DMEM培養(yǎng)液靜止24 h，以使細胞生長同步化。細胞隨機分組:(1)對照組(2%FBS+DMEM+5．5 mmol/L glucose);(2)高糖組(2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose);(3)高糖+0．50 g/L OM動態(tài)觀察組(2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+0．50 g/L OM)，上述3 組分別設(shè)2 h、12 h、24 h、48 h 和72 h 五個培養(yǎng)時點進行動態(tài)觀察;(4)高糖+OM不同濃度組(2%FBS+DMEM+25 mmol/L glucose+0.01、0.05、0．10、0．25、0．50 g/L OM)培養(yǎng) 48 h。各組細胞分別提取蛋白和RNA進行檢測。

3．2 MTT法檢測OM對NRK52E細胞活性的影響 頁碼 電子書="324" 紙書="2154"/>將NRK52E制成2．5×106/L細胞懸液，200μL/well接種到96孔板，待細胞長至80%融合時，加無血清DMEM靜止24 h，根據(jù)DMEM中OM濃度不同分為8組:空白對照組、陰性對照組、0．01 g/L OM組、0．05 g/L OM 組、0．10 g/L OM 組、0．25 g/L OM組、0．50 g/L OM組和1.00 g/L OM組，每組設(shè)4個復孔，培養(yǎng)48 h后取出96孔板，吸棄上清，每孔加入100μL DMEM和10μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO 100μL，繼續(xù)培養(yǎng)，直至在光學顯微鏡下觀察到紫藍色結(jié)晶全部溶解，在全自動酶聯(lián)免疫檢測儀上，測定570 nm處吸光度(以空白對照組調(diào)零)。

3．3 Real-time PCR 根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA，核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。取3μg RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進行real-time PCR。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，循環(huán)40次。在Bio-Rad CFX 96TM熒光定量PCR分析系統(tǒng)上進行，熔解曲線自動生成，每個樣本行3次real-time PCR，以β-actin為內(nèi)參照，目的基因相對含量以 2－ΔΔCt表示。

3．4 Western blotting 裂解液裂解細胞，離心取上清，BCA法測蛋白濃度，加樣緩沖液使蛋白變性，上樣，經(jīng)SDS-PAGE垂直電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，分別與特異性 TGF-β1抗體(1∶200)、Smad7 抗體(1∶300)、α-SMA 抗體(1∶400)、E-cadherin 抗體(1∶400)和 β-actin抗體(1∶400)4℃孵育過夜，TBST洗膜，再與辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Quantity One 4．6軟件進行分析，以 β-actin為內(nèi)參照，目的蛋白的相對表達水平用目的蛋白/βactin灰度比值表示。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 高糖條件下NRK52E細胞中 TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA及蛋白表達的動態(tài)變化

1．1 mRNA表達的動態(tài)變化 Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖組隨處理時間延長，TGF-β1、Smad7和α-SMA mRNA表達逐漸增高，而E-cadherin mRNA表達逐漸降低，且呈時間依賴性(P＜0.05)，見圖 1。

Figure 1．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin mRNA in NRK52E cells treated with 25 mmol/L glucose for 2，12，24，48 and 72 h determined by real-time PCR．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control at the same time．圖1 Real-time PCR方法檢測高糖條件下NRK52E細胞中TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA表達的變化

1．2 蛋白表達的動態(tài)變化 Western blotting結(jié)果顯示，與對照組相比，高糖組隨處理時間延長，TGF-β1和α-SMA蛋白表達逐漸增高，而Smad7和E-cadherin蛋白表達逐漸降低，且呈時間依賴性(P＜0．05)，見圖2。

Figure 2．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin proteins in NRK52E cells treated with 25mmol/L glucose for 2，12，24，48 and 72 h determined by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control．圖2 Western blotting方法檢測高糖條件下NRK52E細胞中TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達的變化

2 MTT結(jié)果

1.00 g/L OM對NRK52E細胞活性有明顯抑制作用(P ＜0．05)，而0．01 ～0．50 g/L OM 對 NRK52E的細胞活性無明顯影響，提示該OM濃度范圍對NRK52E細胞活性無明顯影響，見圖3。

Figure 3．Effects of OM at different concentrations on viability of NRK52E cells detected by MTTassay．Mean ± SD．n=4．*P ＜0．05 vs 0.00 g/L．圖3 MTT法檢測不同濃度OM對NRK52E細胞活性的影響

3 不同濃度OM對高糖條件下NRK52E細胞TGF-β1、Smad7、α-SMA 和 E-cadherin mRNA 及蛋白表達的影響

3．1 對mRNA表達的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，高糖作用48 h 后，TGF-β1、Smad7 和 α-SMA mRNA表達較對照組顯著增高，E-cadherin mRNA表達較對照組顯著降低(P＜0．05);與高糖組相比，高糖+OM不同濃度組隨 OM 劑量增加，TGF-β1和 α-SMA mRNA表達逐漸降低，E-cadherin mRNA表達逐漸增高，呈劑量依賴性(P＜0．05)，Smad7 mRNA表達則 無明顯差異，見圖4。

Figure 4．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin mRNA in NRK52E cells determined by real-time PCR．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs5．5 mmol/L glucose;#P ＜0．05 vs25.0 mmol/L glucose alone．圖4 Real-time PCR方法檢測不同濃度OM對高糖條件下NRK52E細胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA表達的影響

3．2 對蛋白表達的影響 Western blotting結(jié)果顯示，高糖作用48 h后，TGF-β1和α-SMA蛋白表達較對照組顯著增高，Smad7和E-cadherin蛋白表達較對照組顯著降低(P＜0．05);與高糖組相比，高糖+OM不同濃度組隨OM劑量增加，TGF-β1和α-SMA蛋白的表達逐漸降低，Smad7和E-cadherin蛋白表達逐漸增強，且呈劑量依賴性(P＜0．05)，見圖5。

4 0．50 g/L OM 作用不同時間對高糖條件下NRK52E 細胞 TGF-β1、Smad7、α-SMA 和 E-cadherin mRNA及蛋白表達的影響

4．1 對mRNA表達的影響 Real-time PCR結(jié)果顯示，與高糖組相比，高糖+0．50 g/L OM動態(tài)觀察組TGF-β1和 α-SMA mRNA 表達持續(xù)降低，E-cadherin mRNA表達持續(xù)增高(P＜0．05)，Smad7 mRNA表達無明顯差異;與對照組相比，高糖+0．50 g/L OM動態(tài)觀察組TGF-β1、Smad7和 α-SMA mRNA表達明顯增高，而 E-cadherin mRNA表達明顯降低(P＜0.05)，無明顯時間依賴性，見圖6。

4．2 對蛋白表達的影響 Western blotting結(jié)果顯示，與高糖組相比，高糖+0．50 g/L OM動態(tài)觀察組TGF-β1和α-SMA蛋白表達持續(xù)降低，Smad7和E-cadherin蛋白表達持續(xù)增高(P＜0．05);與對照組相比，高糖+0．50 g/L OM動態(tài)觀察組TGF-β1和α-SMA蛋白表達明顯增高，而Smad7和E-cadherin蛋白表達明顯降低(P ＜0．05)，無明顯時間依賴性，見圖7。

討 論

DN是糖尿病最常見的嚴重微血管并發(fā)癥之一，已成為導致終末期腎病和糖尿病患者死亡的主要原因，腎小管間質(zhì)纖維化為其主要病理特征。EMT在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。TGF-β1是目前已證實的致腎小管EMT最強的細胞因子之一，在DN腎組織及高糖刺激的腎小管上皮細胞中 TGF-β1表達都顯著上調(diào)［8］，通過TGF-β1/Smads信號通路誘導腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，進而致腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生。Smad7作為TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路中的負向調(diào)節(jié)因子，能夠阻止或者減弱TGF-β1信號轉(zhuǎn)導通路的生物學效應(yīng)［9-11］。本研究結(jié)果顯示，高糖處理NRK52E細胞不同時間后，隨著處理時間延長，TGF-β1表達呈進行性增高、Smad7蛋白表達進行性降低、間質(zhì)細胞標志物α-SMA表達進行性增高、上皮細胞標志物E-cadherin表達進行性降低，提示，高糖一方面可通過上調(diào)TGF-β1的表達激活TGF-β1/Smads信號通路，另一方面通過下調(diào)Smad7蛋白表達減弱對TGF-β1/Smads信號通路的負調(diào)控作用，而誘導NRK52E細胞EMT的發(fā)生。

Figure 5．Expression of TGF-β1，Smad7，α-SMA and E-cadherin proteins in NRK52E cells determined by Western blotting．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs 5．5 mmol/L glucose;#P ＜0．05 vs 25.0 mmol/L glucose alone．圖5 Western blotting檢測不同濃度OM對高糖條件下NRK52E細胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達的影響

近年研究發(fā)現(xiàn)，OM有免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗心律失常、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗纖維化等多方面的藥理作用，在抗腎臟纖維化中有很好的療效［12］，但關(guān)于OM是否可以通過抑制 TGF-β1表達或促進TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路負調(diào)控因子(如Smad7、SnoN等)的表達，阻礙 TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路，抑制腎小管上皮細胞EMT，進而抑制DN腎小管間質(zhì)纖維化方面的研究國內(nèi)外尚未見報道?；诖耍覀兗僭O(shè):OM可以通過抑制高糖所致的TGF-β1表達上調(diào)和Smad7表達下調(diào)，干預(yù)TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導通路的過度活化，抑制腎小管上皮細胞EMT，進而達到治療腎小管間質(zhì)纖維化的目的。為此，本研究在體外細胞分子水平，通過觀察OM對高糖條件下NRK52E細胞中TGF-β1及Smad7的表達情況，驗證上述假設(shè)，以探討OM對高糖誘導發(fā)生EMT的抑制作用及可能的相關(guān)機制，為OM用于抗DN腎小管間質(zhì)纖維化治療提供重要的理論和實驗依據(jù)。

Figure 6．Expression ofα-SMA，E-cadherin，TGF-β1 and Smad7 mRNA in NRK52E cells determined by real-time PCR．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control at the same time;#P ＜0．05 vs high glucose at the same time．圖6 Real-time PCR檢測0．50 g/L OM對高糖條件下NRK52E細胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin mRNA表達的影響

Figure 7．Expression ofα-SMA，E-cadherin，TGF-β1 and Smad7 proteins in NRK52E cells determined by Western blotting．Mean ±SD．n=3．*P ＜0．05 vs control at the same time;#P ＜0．05 vs high glucose at the same time．圖7 Western blotting檢測0．50 g/L OM對高糖條件下NRK52E細胞TGF-β1、Smad7、α-SMA和E-cadherin蛋白表達的影響

根據(jù)高糖培養(yǎng)48 h的NRK52E細胞明顯發(fā)生EMT，且 MTT 實驗結(jié)果提示 0．01 ～0．50 g/L OM 對NRK52E細胞無明顯毒性作用，所以選擇高糖+0．01～0．50 g/L不同濃度OM共同培養(yǎng)NRK52E細胞48 h，以觀察不同濃度OM對高糖條件下NRK52E細胞中各相關(guān)指標表達的影響，結(jié)果顯示，加OM干預(yù)后NRK52E細胞中TGF-β1及α-SMA mRNA和蛋白表達水平降低，E-cadherin mRNA和蛋白的表達增高，Smad7蛋白的表達增高，且均呈劑量依賴性，提示OM可抑制高糖誘導的 TGF-β1合成分泌增加及Smad7蛋白表達降低，從而抑制EMT的發(fā)生。因上述劑量依賴性實驗中以0．50 g/L OM的效果最佳，故選擇高糖+0．50 g/L OM進行動態(tài)觀察，行時間依賴性實驗以期尋找其發(fā)揮明顯抑制EMT效應(yīng)的最佳時點，結(jié)果顯示:與對照組相比，高糖+0．50 g/L OM動態(tài)觀察組 TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達明顯增高，而E-cadherin mRNA和蛋白表達明顯降低，Smad7蛋白表達明顯降低而其mRNA表達明顯增高，在一定時間范圍內(nèi)無明顯時間依賴性;與高糖

組相比，高糖 +0．50 g/L OM 動態(tài)觀察組 TGF-β1、α-SMA mRNA和蛋白表達持續(xù)降低，Smad7和E-cadherin蛋白表達持續(xù)增高，E-cadherin mRNA表達持續(xù)增高，無明顯時間依賴性，Smad7 mRNA表達無明顯差異，提示0．50 g/L OM可一定程度地抑制EMT發(fā)生。高糖條件下加OM干預(yù)的NRK52E細胞中Smad7蛋白水平較高糖組明顯增高，Smad7 mRNA表達與高糖組均持續(xù)較高水平(兩組間無明顯差異)，提示高糖條件下Smad7表達降低并非發(fā)生在其基因轉(zhuǎn)錄水平而是蛋白水平，結(jié)合其它研究結(jié)果［13-15］，推測其原因可能是:高糖刺激NRK52E細胞上調(diào)TGF-β1表達，通過TGF-β1/Smads信號通路上調(diào)E3泛素連接酶(如Smurf2、Arkadia等)表達，介導 Smad7蛋白的泛素化降解增強而下調(diào)其蛋白表達，蛋白水平的降低可能使其基因轉(zhuǎn)錄水平的負反饋作用減弱，從而致使Smad7 mRNA表達上調(diào)。高糖條件下加入OM后，TGF-β1高表達受抑制，E3泛素連接酶表達水平降低，進而阻斷Smad7蛋白的降解，因而Smad7蛋白水平增高，而關(guān)于Smad7 mRNA持續(xù)高表達的機制有待進一步深入研究探討。綜上所述，OM可抑制高糖誘導NRK52E細胞發(fā)生的EMT，從體外細胞分子水平探索其作用機制，可能與 OM下調(diào) TGF-β1 mRNA和蛋白表達及上調(diào)Smad7蛋白表達，進而抑制TGF-β1/Smads信號通路的致纖維化效應(yīng)有關(guān)。