萬 淼, 洪漢烈

(1. 中國地質(zhì)大學 數(shù)學與物理學院，湖北 武漢 430074；2. 中國地質(zhì)大學 地球科學學院，湖北 武漢 430074)

氟喹諾酮類抗生素自研制以來被不斷用于人類和禽類疾病的治療[1-2]，恩諾沙星作為第二代氟喹諾酮類藥物是第一個動物專用的藥物[3]。但是恩諾沙星為極微溶解的藥物，所以不便使用；為了增加水溶性，可以利用恩諾沙星為兩性化合物這一特點，使其與酸或者堿作用形成便于溶解的酸式鹽或者堿式鹽。鹽酸恩諾沙星則為合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物，又名乙基環(huán)丙沙星或恩氟沙星，為畜禽和水產(chǎn)專用氟喹諾酮類抗菌藥物[4]。

抗生素經(jīng)動物體后大部分以原藥形式隨排泄物排出體外，在廢水[5]、礦物水[6]、未處理飲用水[7]、自來水[8]和地表水[9]等多處水體環(huán)境中都監(jiān)測到殘留藥物，因此針對藥物在水體環(huán)境中的行為、對生態(tài)環(huán)境的影響以及去除其殘留的相關(guān)研究十分有必要。曾有研究表明，恩諾沙星的水溶解度僅為243.28 mg/L[10]，但是未見鹽酸恩諾沙星水溶解度的研究。

檢測抗生素的方法多為高效液相色譜法[10-13]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[14]、化學發(fā)光法[4]及免疫分析法[15]等。但是這些方法有的需要預(yù)處理而耗時，有的所需儀器昂貴。而紫外分光光度計是常用的檢測儀器，其基本工作原理是利用一定頻率的紫外可見光照射被分析的物質(zhì)，引起分子中價電子的躍遷，紫外可見光將有選擇地被吸收。對于一個特定的波長，吸收的程度正比于試樣中該成分的濃度，因此測量光譜可以進行定性分析，而且根據(jù)吸收與已知濃度的標樣的比較，還能進行定量分析[16]。

本研究利用水平搖床法充分溶解鹽酸恩諾沙星，采用紫外可見光分光光度計法測定其平衡水溶解度，并研究了pH對溶解度的影響，為該抗生素的生態(tài)風險評價及相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

鹽酸恩諾沙星(純度為99.7%，購于武漢遠程醫(yī)藥科技有限公司)鹽酸、氫氧化鈉顆粒、去離子水(15 MΩ·cm)。

調(diào)速多用振蕩器(HY-4)、去離子水機(Aquelix 5)、0.22 μm濾膜、雙光束紫外可見分光光度計(TU-1900)、X射線衍射儀 (XRD, Panalytical X'Pert PRO DY2198)、紅外線光譜分析儀(FTIR, Nicolet 6700)。

1.2 試驗方法

室溫下稱取0.400 g鹽酸恩諾沙星溶于8 mL去離子水的離心管中得到過飽和溶液。將若干份相同的樣品同時放在振蕩器上進行水平振蕩，每隔1 h取樣兩管作為平行樣，先在4 500 r/min下離心5 min，取上清液過0.22 μm的濾膜，適當稀釋后取樣4 mL于雙光束紫外可見分光光度計進行檢測分析，從而確定鹽酸恩諾沙星的水溶解度。

為了考察pH對溶解度的影響，進行以下試驗。用天平分別稱取0.400 g鹽酸恩諾沙星溶于8 mL去離子水的離心管中得到過飽和溶液，此時溶液pH為5.3。向離心管中分別加入適量的1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)過飽和溶液的初始pH分別至2.8、4.0、7.0、8.2和9.9；每種pH的樣品同時準備若干份，使用振蕩器進行充分溶解。每過一個小時取樣兩管，先在4 500 r/min下離心5 min，取上清液測量pH，并使其經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾，適當稀釋后取樣4 mL于雙光束紫外可見分光光度計中進行檢測。

1.3 測定方法

X射線衍射儀(Cu Kα，40 kV，40 mA)檢測鹽酸恩諾沙星粉末的結(jié)晶質(zhì)量。紅外線光譜分析儀(KBr壓片法，分辨率4 cm-1)檢測鹽酸恩諾沙星粉末的主要基團成分。采用紫外可見光分光光度計檢測溶液中的鹽酸恩諾沙星的濃度，根據(jù)掃描得到的光譜曲線說明276 nm為最大吸收波長。在該波長下利用濃度和吸收強度的關(guān)系做鹽酸恩諾沙星水溶液的濃度標準曲線，其相關(guān)度為0.999。上述各種飽和溶液的濃度將依據(jù)標準曲線和檢測的吸光度經(jīng)過計算得到，從而可得到鹽酸恩諾沙星的水溶解度。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸恩諾沙星XRD和FTIR結(jié)果

圖1(a)為鹽酸恩諾沙星的結(jié)構(gòu)式，左上角的哌嗪基團和右下角的羧基是其活性基團，從而使其在不同的pH下呈現(xiàn)不同的離子狀態(tài)。圖1(b)為鹽酸恩諾沙星粉末的XRD圖譜，可以看出其結(jié)晶度很好，純度很高。表1列出了紅外圖譜的峰值及來源，其中1 732 cm-1的峰來自羧基中 C=O 的伸縮振動[17-18]，1 391 cm-1的峰來源于哌嗪基團中胺基的質(zhì)子化[19]。

圖1 鹽酸恩諾沙星的結(jié)構(gòu)式(a)與XRD(b)圖譜Fig.1 Molecular structure (a) and X-ray diffraction (b) patterns of crystalline enrofloxacin hydrochloride

表1 鹽酸恩諾沙星的紅外圖譜中的振動頻率Table 1 Vibrational frequencies (cm-1) and assignments of enrofloxacin hydrochloride

2.2 水溶解度的測定及pH對水溶解度的影響

由圖2(a)可以看出，鹽酸恩諾沙星在溶解2 h后其溶解度達到最大值22.739 g/L，之后的1 h溶解度相對減小，溶解度在3 h后趨于平穩(wěn)，第8h的溶解度為19.770 g/L，該值于前1 h的溶解度僅相差2.59%。圖2(b)為不同時刻通過紫外分光光度計得到的吸收光譜。結(jié)果顯示不同時刻吸收峰的位置基本不變；雖然峰的強度和寬度稍有改變，但峰形基本不變。這表明鹽酸恩諾沙星樣品溶液能在8 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

圖2 不同時間鹽酸恩諾沙星的溶解度(a)及鹽酸恩諾沙星溶液的吸收光譜(b)Fig.2 (a) Solubility and (b) adsorptive spectra of enrofloxacin hydrochloride at different time

為了考察pH對鹽酸恩諾沙星水溶解度的影響，用1 M的HCl和NaOH調(diào)整溶液pH。從圖3可看出，在第2至3 h的時候溶解度會出現(xiàn)明顯的減小或增大；隨著平衡時間的延長，溶解度逐漸趨于穩(wěn)定。當pH分別為2.8、4.0、5.3、7.0、8.2和9.9時，溶解度分別為1.161 g/L、10.637 g/L、19.770 g/L、4.198 g/L、1.874 g/L和16.108 g/L(最后兩次相鄰時間點的濃度差均在3%以內(nèi))。鹽酸恩諾沙星水溶液的pH為5.3，從試驗可以看出此時的溶解度是最大的。

圖3 不同pH條件下不同時刻鹽酸恩諾沙星的溶解度Fig.3 Solubility of enrofloxacin hydrochloride at different time at pH value

不同pH下的鹽酸恩諾沙星水溶液中，恩諾沙星將呈現(xiàn)不同的化學形式。恩諾沙星的離解常數(shù)pKa1和pKa2為6.1 和7.7[21]，據(jù)此可得圖4所示的不同形式的恩諾沙星分配圖。當pH低于pKa1時，恩諾沙星中哌嗪基的質(zhì)子化導(dǎo)致恩諾沙星幾乎完全以陽離子形式(EN+)存在；當pH高于pKa2時，羧基的去質(zhì)子化使得恩諾沙星呈陰離子形式(EN-)；當pH介于pKa1和pKa2之間時，恩諾沙星兩性離子(EN±)形式。本試驗中，鹽酸恩諾沙星溶解度最大時的pH為5.3，此時恩諾沙星絕大部分以陽離子(EN+)形式存在，小部分以兩性離子(EN±)形式存在。溶解度次最大時的pH為9.9，此時的恩諾沙星幾乎完全以陰離子 (EN-)形式存在于溶液中。

圖4 不同pH下恩諾沙星的離子形式Fig.4 Speciation of enrofloxacin under different pH conditions

3 小 結(jié)

本研究利用水平搖床溶解鹽酸恩諾沙星，依據(jù)被測物質(zhì)在特定波長處的吸收程度與物質(zhì)質(zhì)量濃度呈正比的關(guān)系，應(yīng)用紫外分光光度計在276 nm的檢測波長下測定鹽酸恩諾沙星的平衡水溶解度，并考察了pH對溶解度的影響。鹽酸恩諾沙星飽和水溶液的pH為5.3，室溫下溶解度為19.770 g/L。調(diào)整溶液pH值分別為2.8、4.0、7.0、8.2和9.9時，室溫下溶解度分別為1.161 g/L、10.637 g/L、4.198 g/L、1.874 g/L和16.108 g/L。鹽酸恩諾沙星平衡水溶解度最大時pH為5.3，此時絕大部分恩諾沙星以陽離子(EN+)形式存在，小部分以兩性離子(EN±)形式存在。溶解度次最大時的pH為9.9，此時溶液中的恩諾沙星幾乎完全以陰離子 (EN-)形式存在于溶液中。

參考文獻：

[1] Witte W. Medical consequences of antibiotic use in agriculture[J]. Science, 1998, 279(5353): 996-997.

[2] Wispelwey B, Schafer K R. Fluoroquinolones in the management of community-acquired pneumonia in primary care [J]. Expert Review of Antiinfective Therapy, 2010, 8(11): 1 259-1 271.

[3] Martinez M, McDermott P, Walker R. Pharmacology of the fluoroquinolones: a perspective for the use in domestic animals [J]. The Veterinary Journal, 2006, 172(1): 10-28.

[4] 于 斐, 王瑞萍, 吳擁軍, 等. 增強化學發(fā)光法測定鹽酸恩諾沙星的含量[J]. 華西藥學雜志, 2010, 25(6): 754-755.

[5] Seifrtová M, Pena A, Lino C M, et al. Determination of fluoroquinolone antibiotics in hospital and municipal wastewaters in Coimbra by liquid chromatography with a monolithic column and fluorescence detection [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 391：799-805.

[6] Herrera-Herrera A V, Hernández-Borges J, Rodríguez-Delgado M. Ionic liquids as mobile phase additives for the high-performance liquid chromatographic analysis of fluoroquinolone antibiotics in water samples [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 392: 1 439-1 446.

[7] Focazio M J, Kolpin D W, Barnes K K, et al. A national reconnaissance for pharmaceuticals and other organic wastewater contaminants in the United States-II) Untreated drinking water sources [J]. Science of the Total Environment, 2008, 402(2-3): 201-216.

[8] Yiruhan, Wang Q J, Mo C H, et al. Determination of four fluoroquinolone antibiotics in tap water in Guangzhou and Macao [J]. Environmental Pollution, 2010, 158(7): 2 350-2 358.

[9] Tong C, Zhou X, Guo Y. Occurrence and risk assessment of four typical fluoroquinolone antibiotics in raw and treated sewage and in receiving waters in Hangzhou, China [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(13): 7 303-7 309.

[10] 吳銀寶，汪植三，廖新俤，等. 恩諾沙星水溶解度及正辛醇與水分配系數(shù)的測定[J]. 家畜生態(tài)學報, 2005, 26(5)：76-79.

[11] 莊春梅，錢毅玲. 高效液相色譜法評定動物性食品中恩諾沙星的不確定度[J]. 安全檢測, 2011(12): 76-78.

[12] 賈 濤. UPLC檢測飼料中恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星[J].飼料研究, 2012(10): 71-74.

[13] 劉薈嶺, 劉中成, 于文會, 等. HPLC法測定雞血清與雞肉中恩諾沙星含量的對比試驗[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2013(5): 66-68.

[14] 劉芃巖, 姜 寧, 王英峰, 等. 高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞肉中殘留的磺胺類和氟喹諾酮類獸藥[J]. 色譜, 2008, 26(3): 348-352.

[15] 楊正濤, 張乃生, 魏 東. 氟喹諾酮類藥物多組份殘留的酶免疫分析法[J] . 中國獸醫(yī)學報, 2008, 28(9): 1 057-1 060.

[16] 譚勝國，吳鎮(zhèn)金，印懷文，等. 紫外可見分光度法測定恩諾沙星原料中恩諾沙星的含量[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技, 2008, 33(5): 23-24.

[17] Trivedi P, Vasudevan D. Spectroscopic investigation of ciprofloxacin speciation at the goethite-water interface [J]. Environmental Science & Technology, 2007, 41(9), 3 153-3 158.

[18] Martinez Y N, Piel L, Castro G R, et al. Polyvinyl alcohol-pectin cryogel films for controlled release of enrofloxacin [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 167: 1 421-1 429.

[19] Goyner K W, Chorover J, Kubicki J D, et al. Sorption of the antibiotic ofloxacin to mesoporous and nonporous alumina and Silica [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2005, 283(1): 160-170.

[20] Yan W, Zhang J, Jing C. Adsorption of enrofloxacin on montmorillonite: two-dimensional correlation ATR/FTIR spectroscopy study [J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2013, 390(1): 196-203.

[21] Barbosa J, Barrón D, Jiménez-Lozano E, et al. Comparison between capillary electrophoresis, liquid chromatography, petentiometric, and spectrophotometric techniques for evaluation of pKa values of zwitterionic drugs in acetonitrile-water mixtures[J]. Analytica Chimica Acta, 2001 437(27): 309-321.