姜雪鷗，鐘金城

(西南民族大學(xué) 動物遺傳育種學(xué)國家民委-教育部重點實驗室，四川 成都 610041)

動物線粒體基因組中通常含有2個rRNA、13個結(jié)構(gòu)蛋白基因、22個tRNA和1個D-loop區(qū)[1]。按照母性遺傳方式傳代，其分子量小，拷貝數(shù)多，進化速度很快，堿基的替代率比單拷貝核DNA基因組快6～10倍。12SrRNA基因是在進化上比較保守，通常被用于系統(tǒng)發(fā)生和分子進化的研究[2]。

牦牛是牛屬動物中唯一繁殖在青藏高原及其毗鄰高寒牧區(qū)的牛種，一般生活在海拔3 000 m以上的高山、亞高山地區(qū)，對低氧、高寒等惡劣的環(huán)境具有很強的適應(yīng)能力, 同時，該物種對于缺氧環(huán)境的適應(yīng)能力具有很大的生態(tài)可塑性[3]。

本文以西藏11個牦牛品種為研究材料，首次對它們的mtDNA 12SrRNA基因全序列進行了測定及分析，并在11個群體內(nèi)進行同源性比較和分子信息學(xué)的探討，為今后深入研究牦牛線粒體基因的分子特征、種群結(jié)構(gòu)等方面提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及血樣采集

從11個西藏牦牛品種或類群中，隨機選取健康成年牦牛110頭，采集耳組織，75%乙醇保存，低溫帶回實驗室，-80 ℃保存(牦牛的品種及數(shù)量見表1)。

1.2 酶和試劑

Tris-Base、氯仿、95%酒精、DNA Marker 2000、蛋白酶K、EDTA、硼酸、IPTG、飽和酚、X-gal、氨卞青霉素、瓊脂粉等均購自大連寶(TakaRa)生物工程有限公司；動物基因組DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 菌株和載體

大腸桿菌DH5α由成都天泰生命科技有限公司提供；pMD19-T Vector載體購自大連寶(TakaRa)生物有限公司。

1.4 基因組DNA提取及檢驗

采用的是常規(guī)的酚-氯仿法提取動物組織的基因組DNA[4]，用1%～1.5%的瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度計法雙重檢測DNA的濃度和純度，并將所提DNA產(chǎn)物置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物的設(shè)計、合成及稀釋

參照NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已有的亞洲水牛(GenBank Accession No：AY488491.1)、非洲水牛(GenBank Accession No：EF536353.1)、歐洲野牛(GenBank Accession No：HM045017)和家牛(GenBank Accession No：EU177829)的12SrRNA序列，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件DNAMAN和Primer Premier 5.0設(shè)計引物，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司(cnservice.invitrogen.com)合成。引物序列為：PF：5′-GGCACTGAAAATGCCTAGATG-3′與PR：5′-GCATACTGGAAAGTGTGCTTG-3′。

表1 樣本信息Table 1 Information of samples

1.6 PCR擴增

PCR的擴增體系：總體系為25 μL，包括MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μL，滅菌去離子水，14.85 μL dNTP(各2.5 mmol/L) 2 μL，模板DNA(50 ng/μL)2 μL，10×Buffer(Mg2+Free)2.5 μL，上、下游引物各1 μL，ExTaq (5 U/μL)0.15 μL。

PCR的擴增程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s， 30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 PCR產(chǎn)物的的克隆

PCR產(chǎn)物參照DNA凝膠回收試劑盒說明書進行回收純化，用pMDTM19-T Vector與回收的目的片段在恒溫16 ℃的金屬浴中反應(yīng)連接2～8 h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中培養(yǎng)；再將培養(yǎng)好的菌液涂在含有X-Gal 底物、氨芐青霉素、IPTG 誘導(dǎo)物的固體培養(yǎng)基平板上，利用藍白斑法進行篩選；用滅菌好的牙簽去挑取白色的單一菌落，在含有氨卞青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過PCR 法進行轉(zhuǎn)化子鑒定克隆是否成功。

1.8 測序及分析

提取陽性重組質(zhì)粒，將其送往英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。測序結(jié)果用BioXM、DNAMAN、dnasp5等軟件進行序列比對分析；用MEGA生物信息學(xué)軟件構(gòu)建不同的物種間系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 mtDNA D-loop擴增結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示有清晰明亮的區(qū)帶，片段長度應(yīng)為1 008 bp左右，由圖1可看出，牦牛的mtDNA D-loop區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Electrophoretic agarose gel of PCR amplification

2.2 牦牛12SrRNA全序列的長度與堿基組成

本研究測定的11個牦牛類群110個個體的12SrRNA全序列，長度為962 bp、963 bp、964 bp或965 bp，T、C、A、G 4種核苷酸的平均比例分別為22.5%(22.4%～22.7%)、23.2%(23.0%～23.3%)、36.6%(36.4%～36.7%)、17.8%(17.7%～17.8%)，見表2。

2.3 12SrRNA基因的遺傳多樣性

通過dnasp5軟件分析110只牦牛，共檢測出35種單倍體(見表3)，其中帕里牦牛的單倍型高于其他8個類群，而桑日牦牛的單倍型數(shù)最小，為2。Tajima′s D檢驗是中性檢驗的一種，BQ、DQ、GD、PL、SB的Tajima′s D統(tǒng)計值為正值或者接近零(P>0.05)，說明中性檢驗不顯著，序列進化方式為平衡選擇，且有一些單倍型分化；而其他6個類群的Tajima′s D統(tǒng)計值均為負值(0.01

根據(jù)測得的序列推算其氨基酸序列組成(見表4),結(jié)果顯示，在11個類群的牦牛中，12SrRNA均含有20種氨基酸，共由321個氨基酸組成，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)：12SrRNA各氨基酸平均含量在1%～11%之間變化，亮氨酸(Leu)的含量最高，為10.75%；苯丙氨酸(Phe)的含量最低，為1.60%。

表2 西藏11個類群牦牛12SrRNA基因片段的堿基組成比較Table 2 The base composition of of 12SrRNA of Tibetan yak

表3 西藏11個類群牦牛12SrRNA基因的核苷酸多樣性和單倍型多樣性Table 3 The nucleotide diversity and haplotype diversity of 12SrRNA of Tibetan yak

表4 11種西藏牦牛12SrRNA的氨基酸組成Table 4 Average amino-acid composition of 12SrRNA of Tibetan yak

2.4 11種牦牛類群12SrRNA基因序列間差異

應(yīng)用Mega 5 軟件算出了11種牦牛及亞洲水牛、非洲水牛、歐洲野牛和家牛四種牛亞科12SrRNA序列間的相對遺傳距離，它們之間的序列差異在0.000～0.082(見表5)。其中帕里牦牛、斯布牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、江達牦牛與工布江達牦牛的序列差異最小為0.000，表明它們的親緣關(guān)系最近；康布牦牛與非洲水牛的序列差異最大為0.082，表明它們的親緣關(guān)系最遠。圖3表明，相對于亞洲水牛、非洲水牛、歐洲野牛和家牛四種牛亞科的關(guān)系，西藏11種牦牛類群之間的遺傳距離更近，同源性更高。

2.5 分子系統(tǒng)進化

分別用鄰接法和最小進化法構(gòu)建11種西藏牦牛與亞洲水牛、非洲水牛、歐洲野牛和家牛四種牛亞科的12SrRNA基因序列系統(tǒng)進化樹，如圖2～3所示，兩種方法得出大致相同的拓撲結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示：

表5 11種西藏牦牛12SrRNA兩兩序列間的遺傳距離Table 5 The genetic distance among 11 groups of 12SrRNA of Tibetan yak

注：1-15分別為BQ、DQ、GD、JD、JL、KB、LWQ、PL、SB、SR、SS、B.taurus、B.bubalis、S.caffer、B.bonasus

Note: No.1 to 15 are BQ、DQ、GD、JD、JL、KB、LWQ、PL、SB、SR、SS、B.taurus、B.bubalis、S.cafferandB.bonasusrespectively.

圖2 用ME法構(gòu)建的12SrRNA基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.2 The ME phylogenetic tree between 11 groups of 12SrRNA

圖3 用N-J法構(gòu)建的12SrRNA基因序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 The N-J phylogenetic tree between 11 groups of 12SrRNA

帕里牦牛、斯布牦牛、巴青牦牛、丁青牦牛、江達牦牛、工布江達牦牛、康布牦牛與桑日牦牛同屬于一個單倍型，它們先與嘉黎牦牛聚在一起；桑桑牦牛和類烏齊牦牛為同一單倍體；以上兩聚合枝聚為一個合枝；家牛與非洲野牛聚在一起，亞洲水牛與非洲水牛聚在一起。11種西藏牦牛是同一屬的，因而它們之間的親緣關(guān)系比較近。枝上數(shù)值為重復(fù)1000次的支持率。以上系統(tǒng)進化關(guān)系還可以從11種牦牛與亞洲水牛、非洲水牛、歐洲野牛和家牛四種牛亞科的遺傳距離得以驗證(見表3)。

3 討 論

本試驗根據(jù)NCBI上已有的亞洲水牛、非洲水牛、歐洲野牛和家牛四種牛類的線粒體基因組的信息設(shè)計引物，成功擴增出西藏牦牛的線粒體12SrRNA基因序列。

該基因長度為962～965 bp之間，其堿基含量與其他的牛類相近。A+T含量59.1%顯著高于G+C含量40.8%，表現(xiàn)出一定的堿基偏好性。相對于已經(jīng)研究的牦牛線粒體D-Loop控制區(qū)序列和細胞色b基因相比較，西藏牦牛的(A+T)% 略低[5-6]。序列比對還發(fā)現(xiàn)，12SrRNA基因在線粒體基因組中的位置較為保守。

Nei的定義說明核苷酸差異數(shù)目(歧義度)值越小，說明該群體的遺傳多樣性越低[7]。本研究測得11個牦牛類群間的核苷酸歧義度在0.01890～0.08774之間變化，而總的核苷酸歧義度為0.06421，表明群體間遺傳變異大于群體內(nèi)遺傳變異，說明西藏牦牛群體的遺傳變異主要存在于種群間。

一些物種mtDNA的研究表明，細胞色素b基因和D-Loop控制區(qū)序列可適于屬內(nèi)不同種內(nèi)種間的系統(tǒng)發(fā)育分析[7-9]。而很多研究認(rèn)為，12SrRNA序列更適合較高階元類群的系統(tǒng)發(fā)育分析，相對而言，在一些低階的魚類等類群，線粒體進化較快的區(qū)段12SrRNA基因序列不能夠提供有效的信息含量[10-12]。近年來，線粒體12SrRNA的二級結(jié)構(gòu)模型及變型在牦牛的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中得到廣泛應(yīng)用，以至于將成為今后的進一步探討內(nèi)容[13-16]。

本研究首次對牦牛的12SrRNA基因進行克隆測序，并對其基因結(jié)構(gòu)進行了初步分析，為探究牦牛線粒體基因組的遺傳特點、物種進化關(guān)系以及物種多樣性分析等提供參考。

參考文獻:

[1] Li Ming,Wei Fu-wen,Huang Cheng-ming. Phylogeny of Snub-Nosed Monkeys Inferred From Mitochondrial DNA Cytochrome B and 12S rRNA Sequences[J]. International Journal of Primatology, 2004,25(4):861-873.

[2] Chen Yi-yu，He Shun-ping，Wang Wei. Mitoehondrial d-loop sequence variation and phylogeny of gobioboline fishes[J]. Progress in Natural Sciences, 2002,12(11):866-868．

[3] 金 雙，鐘金城，陳智華,等. 牦牛EPO基因部分片段的克隆測序及其分析[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2007,39(2):25-27.

[4] Sambrook J, Fritsch EH, Maiatis T. 分子生物學(xué)實驗指南[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1998：26-31.

[5] 劉 強. 從線粒體細胞色素b基因和D-Loop控制區(qū)序列差異研究野牦牛和家牦牛的系統(tǒng)進化關(guān)系[D].杭州：浙江大學(xué)，2005.

[6] 楊萬遠，陳雪梅，鐘金城. 野牦牛mtDNA Cytb基因全序列測定及系統(tǒng)進化關(guān)系[J]. 中國草食動物，2009(3):8-13.

[7] Zullo S, Sieu L C, Slightom J L, et al. Mitochondrial D-loop sequences are integrated in the rat nuclear genome[J]. Journal of Molecular Biology, 1991,221(4):1 223-1 235.

[8] 姬秋海. 中國牦牛品種資源的研究進展[J]. 自然資源學(xué)報, 2001,16(6):564-570.

[9] Vun V F, Mahani M C, Lakim M. Phylogenetic relationships of leaf monkeys (Presbytis; Colobinae) based on cytochrome b and 12S rRNA genes[J]. Genetics and Molecular Research, 2011,10(1):368-381.

[10] Oakenfull E A ,Ryder O A. Mitochondrial control region and 12S rRNA variation in Przewalski's horse (Equus przewalskii)[J]．Animal Genetics, 1998,29:456-459.

[11] Emna Mkaouar rebai, Nourhene Fendri kriaa, Nacim Louhichi. Whole mitochondrial genome screening in two families with hearing loss: detection of a novel mutation in the 12S rRNA gene[J]. Bioscience Reports, 2010,30 (6):405-411.

[12] Ballard J W,Olsen G J,Faith D P. Evidence from 12S ribosomal RNA sequences that onychophorans are modified arthropods[J]. Science, 1992,258:1 345-1 348.

[13] Brutto S L,Arculeo M,Sara M. Mitochondrial simple sequence repeats and 12S-rRNA gene reveal two distinct lineages of Crocidura russula(Mammalia, Soricidae)[J]. Heredity, 2004,92:527-533.

[14] 李齊發(fā)，李隱俠，趙興波. 牦牛線粒體DNA細胞色素b基因序列測定及其起源、分類地位研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報, 2006,37(11):1 118-1 123.

[15] Alejandro Espinosa De Los Monteros. Models of the Primary and Secondary Structure for the 12S rRNA of Birds: A Guideline for Sequence Alignment[J]. DNA Sequence, 2003,14(4): 241-256.

[16] 鄭 冬，劉學(xué)東，馬建章. 12SrRNA基因及其二級結(jié)構(gòu)在系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003,31(3):59-61.