李佩佩，郭遠(yuǎn)明，陳雪昌，張小軍，梅光明，劉 琴

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316100)

甲基睪酮(Methyltestosterone，MET)和己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)屬同化激素，分別作為人工合成的雄性和雌性激素，對(duì)促進(jìn)蛋白合成和提高產(chǎn)量具有較強(qiáng)作用，可大幅度提高動(dòng)物養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益［1］。然而其在人體的極小殘留也會(huì)造成人內(nèi)分泌紊亂、性早熟、胎體中毒、致畸致癌等嚴(yán)重后果［1］。因此美國(guó)和歐盟等國(guó)家和組織通過(guò)立法限制或禁止食用性動(dòng)物飼養(yǎng)中使用此類(lèi)激素［2］，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將這兩種激素列入禁止用于所有食品動(dòng)物藥品目錄［3］。有資料報(bào)道水產(chǎn)業(yè)飼料中有甲基睪酮和己烯雌酚違法添加現(xiàn)象，因此快速、準(zhǔn)確檢測(cè)這兩種激素對(duì)于水產(chǎn)品安全監(jiān)控具有重要意義。

目前甲基睪酮和己烯雌酚的檢測(cè)方法主要有氣相色譜－質(zhì)譜法［4－6］、高效液相色譜法［7－9］、高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法［10－15］等。已有的水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)將甲基睪酮和己烯雌酚分別測(cè)定，也有文獻(xiàn)采用液相色譜－質(zhì)譜法將兩者與其它同化激素同時(shí)測(cè)定［16］。本文采用凝膠滲透色譜凈化樣品，經(jīng)固相萃取再次凈化后進(jìn)高效液相色譜測(cè)定水產(chǎn)品中的甲基睪酮和己烯雌酚，成功解決了同化激素前處理過(guò)程中的基質(zhì)干擾問(wèn)題。本方法回收率較高、檢出限較低、檢測(cè)效率較高，適用于水產(chǎn)品中兩種激素的同時(shí)常規(guī)檢測(cè)，同時(shí)也適用于脂肪含量較高的水產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters 2695高效液相色譜儀(配2489紫外檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司);GPC Ultra全自動(dòng)凝膠凈化在線(xiàn)濃縮系統(tǒng)(德國(guó)LCtech公司);T18勻漿機(jī)、MS2漩渦混合器(德國(guó)IKA公司);Centrifuge 5810高速離心機(jī)(Eppendorf公司);N－EVAP112氮吹儀(Organomation公司);R－215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司);固相萃取裝置(美國(guó)Agilent公司);Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL，美國(guó)Waters公司)。

甲基睪酮、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(純度＞99%，德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司):分別用甲醇溶解并配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再根據(jù)需要稀釋成相應(yīng)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。乙醚、甲酸、甲醇(色譜純)，環(huán)己烷、乙酸乙酯(農(nóng)殘級(jí))均為Merck公司產(chǎn)品;Na2CO3(分析純，上海國(guó)藥試劑集團(tuán));實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q制備超純水;其他試劑均為分析純。

1.2 樣品前處理

實(shí)驗(yàn)所用的水產(chǎn)品為草魚(yú)、對(duì)蝦和鰻鱺，按照SC/T3016的規(guī)定處理后于－18℃冰箱密封保存。

稱(chēng)取(5±0.02)g充分勻漿的樣品于50 mL離心管中，加入15 mL乙醚和2 mL 10%的Na2CO3溶液，加塞漩渦混勻5 min，超聲提取5 min，6 000 r/min離心5 min，吸取上清液至100 mL雞心瓶中，向下層殘?jiān)性偌尤?5 mL乙醚重復(fù)提取一次，合并上清液至雞心瓶中于35℃下緩慢旋轉(zhuǎn)蒸干。用10 mL乙酸乙酯－環(huán)己烷(1∶1，體積比)分兩次充分溶解殘?jiān)?jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)移至GPC專(zhuān)用濃縮小瓶中。放置好濃縮瓶和收集瓶，開(kāi)始GPC凈化。收集24～35 min的餾分，40℃下氮吹至干。加入4 mL 10%的甲醇水溶液，漩渦混勻后過(guò)HLB柱(使用前用4 mL甲醇和4 mL水活化)，以20%甲醇水溶液淋洗，低真空抽干或擠干，以4 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于40℃水浴下氮吹至干，殘?jiān)? mL流動(dòng)相充分溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)HPLC檢測(cè)。

1.3 色譜條件

色譜柱:X－Bridge C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－水(72∶28);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。

1.4 GPC條件

柱子類(lèi)型:GPC 10010(500 mm×25 mm);填料:50.0 g Bio－Beads SX－3(中性、多孔的聚苯乙烯－二乙烯基苯微球體;排斥極限:相對(duì)分子質(zhì)量400～14 000)，柱床高32 cm;流動(dòng)相:乙酸乙酯－環(huán)己烷(1∶1);流速:5.0 mL/min;樣品定量環(huán):5.0 mL，濃縮至2 mL;預(yù)淋洗體積:85 mL;洗脫體積:50 mL;清洗體積:35 mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

己烯雌酚易溶于乙醇、乙醚、氯仿、脂肪油或強(qiáng)堿溶液;甲基睪酮極性稍低于己烯雌酚，易溶于乙醇、丙酮、氯仿和醚類(lèi)［1］。文獻(xiàn)報(bào)道常用甲醇作為兩者的提取劑［11］，而甲醇易溶于水且沸點(diǎn)較高，不易蒸干，考慮到后續(xù)GPC凈化要求無(wú)水，因此選擇不溶于水且易蒸干的乙醚作為提取液。實(shí)驗(yàn)表明乙醚對(duì)兩者的提取效率均在90%以上。

2.2 GPC凈化條件的確定

甲基睪酮和己烯雌酚同屬蛋白同化激素，脂溶性強(qiáng)，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重，有效去除雜質(zhì)是準(zhǔn)確定量和實(shí)現(xiàn)低檢出限的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)采用凝膠滲透色譜(GPC)凈化樣品。GPC基于分子大小分離原理，可有效去除色素、油脂等干擾物，常用于農(nóng)藥的多殘留分析，但應(yīng)用于激素類(lèi)藥物殘留分析的報(bào)道并不多見(jiàn)。孫漢文等［17］利用凝膠滲透－固相萃取技術(shù)檢測(cè)了牛肉中甲基睪酮等9種類(lèi)固醇激素;謝維平等［18］采用凝膠滲透色譜凈化/高效液相色譜法測(cè)定了魚(yú)肉中己烯雌酚等5種激素。GPC凈化的關(guān)鍵是選擇合適的切割時(shí)間以有效去除脂肪并保證藥物的回收率。本實(shí)驗(yàn)采用GPC標(biāo)準(zhǔn)柱，參考給出的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)凈化條件，根據(jù)甲基睪酮和己烯雌酚的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，改變了洗脫時(shí)間和主收集時(shí)間，用50 μg/kg的基質(zhì)加標(biāo)樣品進(jìn)GPC凈化，根據(jù)色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算回收率并考察除脂效果(見(jiàn)表1)。在表1中方案1即1 200～2 160 min的實(shí)驗(yàn)條件下，雜質(zhì)去除較為理想且兩種藥物的回收率均在85%以上。故選擇24～36 min作為收集時(shí)間。為更好地去除雜質(zhì)干擾，進(jìn)一步降低檢出限，GPC凈化后的樣品再過(guò)HLB固相萃取柱進(jìn)一步凈化。

表1 3種GPC條件及回收率比較Table 1 Comparison of three GPC conditions and recoveries

2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

同化激素在紫外區(qū)有較強(qiáng)吸收，根據(jù)這兩種激素對(duì)紫外光的吸收性質(zhì)，分別于245、254 nm波長(zhǎng)下對(duì)其進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)254 nm時(shí)兩者分離效果好、響應(yīng)值較高，譜圖基線(xiàn)較平穩(wěn)，基質(zhì)加標(biāo)樣品在此波長(zhǎng)下干擾較低，故選擇最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

圖1 0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)及鰻鱺樣品加標(biāo)50.0 μg/kg MET和DES(B)的色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 0.5 mg/L mixed standard solution(A)and blank eel sample spiked with 50.0 μg/kg MET and DES standard(B)

2.4 流動(dòng)相的選擇

采用甲醇－水(73∶27)為流動(dòng)相測(cè)定空白基質(zhì)加標(biāo)樣品，己烯雌酚在約4.8 min出峰，甲基睪酮在約6.8 min出峰，而雜質(zhì)峰最后流出時(shí)間為4.2 min左右，和己烯雌酚的保留時(shí)間較為接近。當(dāng)測(cè)定較低濃度的加標(biāo)樣品時(shí)發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰對(duì)己烯雌酚峰有影響，干擾定量分析，也易出現(xiàn)樣品假陽(yáng)性問(wèn)題，因此逐步降低了有機(jī)相比例以延長(zhǎng)兩種激素的保留時(shí)間，最終確定流動(dòng)相為甲醇－水(72∶28)。此條件下，兩者的保留時(shí)間均推遲了約2.5 min，消除了雜質(zhì)干擾。0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖和鰻鱺樣品加標(biāo)50.0 μg/kg MET和DES的色譜圖見(jiàn)圖1。

2.5 線(xiàn)性范圍與檢出限

用甲基睪酮和己烯雌酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制質(zhì)量濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.5、2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)樣后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍。將空白樣品加標(biāo)液逐級(jí)稀釋?zhuān)⌒旁氡萐/N=3的樣品濃度為方法檢出限(LOD)，取信噪比S/N=10的樣品濃度為方法定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，兩種激素在各自線(xiàn)性范圍內(nèi)，峰面積(Y)與其質(zhì)量濃度(X)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999(見(jiàn)表2)。方法檢出限和定量下限均可滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)的需要。

2.6 方法回收率與精密度

選擇鰻鱺和對(duì)蝦作為空白樣品，添加10.0、50.0、200 μg/kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其回收率和精密度，采用50.0 μg/kg添加水平連續(xù)測(cè)定5 d，計(jì)算日間精密度，結(jié)果如表3所示。2種激素的平均回收率在84%～93%之間，日內(nèi)精密度和日間精密度均小于6.0%。

表2 甲基睪酮與己烯雌酚的線(xiàn)性方程、線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限及定量下限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients(r)，detection limits(LODs)and quantitation limits(LOQs)of MET and DES

表3 樣品中甲基睪酮和己烯雌酚的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of MET and DES(n=5)

2.7 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用建立的方法對(duì)舟山市場(chǎng)上購(gòu)得的羅非魚(yú)、對(duì)蝦和鰻鱺各10個(gè)樣品進(jìn)行肌肉中甲基睪酮和己烯雌酚殘留量的測(cè)定。結(jié)果在這些樣品中均未檢出這兩種激素，表明該批樣品無(wú)甲基睪酮和己烯雌酚的安全隱患。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了水產(chǎn)品中甲基睪酮和己烯雌酚殘留的凝膠滲透色譜－固相萃取凈化/高效液相色譜檢測(cè)方法，通過(guò)GPC的良好凈化能力，有效降低了基質(zhì)干擾，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了方法的檢測(cè)靈敏度，分離效果良好，可滿(mǎn)足日常監(jiān)測(cè)工作的需要。

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