關(guān) 鷹，王 弋，郭小勤，林新春，方 偉

（浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 臨安 311300）

多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）是一種能與Cu鏊合的膜結(jié)合蛋白，于1895年被發(fā)現(xiàn)，廣泛分布于動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中[1]。多酚氧化酶有三種類型，分別為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶。植物中，多酚氧化酶參與生物合成、光合作用、植物抗逆及褐化等過(guò)程[2]，尤其是在酶促褐變過(guò)程中，多酚氧化酶起關(guān)鍵作用[3]，它能作用于底物酚類物質(zhì)而引起材料的褐化[4]。近幾十年來(lái)，研究人員除了對(duì)多種植物的多酚氧化酶進(jìn)行研究外，還克隆了編碼基因，并對(duì)這些基因的結(jié)構(gòu)、表達(dá)情況及功能進(jìn)行了分析。

本實(shí)驗(yàn)從紫竹（Phyllostachys nigra）栽培類型一年紫中克隆了該基因的片段，對(duì)其序列分析顯示，該序列與此前從臺(tái)灣紫竹中獲得的另一個(gè)同源基因片段有一定的差異，顯示出該基因在不同栽培類型中具多態(tài)性。組織特異性分析結(jié)果顯示，該基因在一年紫幼嫩部位的表達(dá)量高于其他成熟組織。

1 材料與方法

1.1 材料

在浙江農(nóng)林大學(xué)翠竹園采集一年生紫竹的幼嫩葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，－20℃保存?zhèn)溆?。在同一株上采集莖、筍尖、全筍、鞭根、葉芽，采用Trizol法提取其總RNA，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 紫竹PnPPO1基因片段的克隆

利用Primer軟件參照GeneBank上所登錄的PPO基因保守序列設(shè)計(jì)兼并引物，PnPPO1上游引物：5'-TTCGCGCTGCCGTTCTGGAA-3'，下游引物：5'-GATGTGCCACATGCGGTCGA-3'。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：10×PCR buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.4 μL，上游引物（10 μmol/L）2 μL，下游引物（10 μmol/L）2 μL，Taq DNA聚合酶 0.15 μL，模板DNA 1.0 μL（100 ng），ddH2O 12.45 μL。PnPPO1反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃：3 min，94℃：30 s，50℃：30 s，72℃：1 min，38個(gè)循環(huán)，72℃：5 min，4℃保溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。用鼎國(guó)XA014-1膠回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行割膠回收，連接到pMD20-T載體（大連寶生物公司），連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受細(xì)胞DH5α，挑取白斑，提取質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切檢測(cè)，確定結(jié)果正確后進(jìn)行測(cè)序。

1.3 紫竹PnPPO1基因的組織特異性表達(dá)分析

以所提取的莖，筍尖，全筍，鞭根，葉芽的總RNA為材料，參照試劑說(shuō)明書分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用半定量PCR法對(duì)紫竹上述部位PnPPO1基因的表達(dá)進(jìn)行分析。以β-actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)。β-actin反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，27個(gè)循環(huán)，72℃延伸5 min。PnPPO1反應(yīng)程序如上，循環(huán)數(shù)為28循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PnPPO1基因片段的克隆及序列分析

以紫竹一年紫嫩葉 cDNA為模板，以PnPO1引物進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收，轉(zhuǎn)化，測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該片段長(zhǎng)438 bp，核苷酸序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該序列為PPO同源基因，該基因與水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestiv）、蓮（Nelumbo nucifera）、荔枝（Litchi chinensis）、玉米（Zea mays）等植物的PPO基因序列有很高的同源性，其中與小麥的同源性達(dá)到 75%，故將其命名為PnPPO1。DNAMAN分析顯示，該片段編碼146個(gè)氨基酸（圖1），蛋白分子量約為36.2 kD，等電點(diǎn)為5.03。Blastp結(jié)果顯示，該蛋白屬于酪氨酸酶（圖2），具有PPO蛋白典型的特征，含有1個(gè)保守的CuB結(jié)合區(qū)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)域有4個(gè)保守的H（His）和一個(gè)F（Phe）（圖1）。

圖1 PnPPO1 cDNA及氨基酸序列Figure1 cDNA and amino acid sequence of PnPPO1

圖2 PnPPO1基因編碼的部分氨基酸序列的比對(duì)結(jié)果Figure2 The blastp of PnPPO1partial amino acid sequence

利用ProtParam對(duì)PnPPO1氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，該氨基酸序列不穩(wěn)定指數(shù)較高（表1）。利用TMHMM2.0在線預(yù)測(cè)了PnPPO1的跨膜情況，結(jié)果顯示，PnPPO1蛋白在該區(qū)段沒(méi)有發(fā)現(xiàn)跨膜位點(diǎn)并且膜外概率高于膜內(nèi)，PPO蛋白有可能是一個(gè)膜外蛋白（圖3）。

表1 一年紫PnPPO1氨基酸殘基理化性質(zhì)分析Table1 Physio-chemical characteristics analysis of PnPPO1 amino acids

運(yùn)用ProtScale對(duì)PnPPO1的氨基酸殘基進(jìn)行疏水性分析顯示，總體上親水氨基酸明顯多于疏水氨基酸（圖4），說(shuō)明一年紫PnPPO1蛋白在該區(qū)域顯示較高的親水性。

另外，所擴(kuò)增到的該氨基酸片段具有α-螺旋（含量10.28%），β-折疊（4.79%）且α-螺旋串通不同長(zhǎng)度的無(wú)規(guī)則卷曲（84.93%）。

對(duì)從一年紫和臺(tái)灣紫中獲得兩條PPO序列進(jìn)行分析，比對(duì)結(jié)果顯示，兩者同源性為86.45%，兩序列間除了片段缺失外，還存在明顯的 SNP位點(diǎn)，多態(tài)性頻率為 1 SNP/27.3bp，其中以A/G轉(zhuǎn)換類型最多，占81.25%。由于單堿基的變異，一年紫和臺(tái)灣紫中酶切位點(diǎn)也會(huì)發(fā)生變化，從圖4中可以看出，由于單核苷酸的變異，有6處酶切位點(diǎn)發(fā)生了變化，其中5處為新酶切位點(diǎn)的產(chǎn)生，1處表現(xiàn)為酶切位點(diǎn)的變換（圖5）。

圖3 一年紫PnPPO1跨膜預(yù)測(cè)Figure3 Predicted transmembrane of PnPP01

2.2 PnPPO1基因的組織特異性表達(dá)

為研究PnPPO1基因在一年紫不同組織部位中的表達(dá)情況，以β-actin基因?yàn)閷?duì)照，對(duì)PnPPO1進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果如圖6。由圖6可知，在所檢測(cè)的5個(gè)組織中，該基因在葉芽中的表達(dá)量最高，在鞭根中微量表達(dá)，而在其余的組織未檢測(cè)到其表達(dá)。

圖4 一年紫PnPPO1基因保守區(qū)推斷的氨基酸序列疏水圖Figure4 Hydrophobic analysis of on amino acids in the PnPPO1 sequence

圖5 一年紫PnPPO1與臺(tái)灣紫PnPPO的序列比對(duì)Figure5 Alignment sequence between PnPPO1and PnPPO1

圖6 PnPPO1的組織特異性表達(dá)Figure6 Expression pattern of PnPPO1

3 結(jié)論與討論

本研究利用同源克隆技術(shù)從一年紫嫩葉中獲得PnPPO1的cDNA序列，與之前從臺(tái)灣紫中獲得的序列的同源性為 86.45%，兩序列間除了堿基缺失外，還存在有豐富的SNP位點(diǎn)，且以A/G型轉(zhuǎn)換位點(diǎn)最豐富。研究表明，PPO蛋白具有3個(gè)Cu結(jié)合區(qū)域（CuA、CuB、CuC），CuA與PPO的水溶性有關(guān)，CuB是底物結(jié)合的最關(guān)鍵區(qū)域，CuC與分子氧相連且調(diào)節(jié)葉綠體中有害光氧化反應(yīng)，參與電子傳遞，起能量轉(zhuǎn)換作用[5]。在實(shí)驗(yàn)獲得的146個(gè)氨基酸殘基中存在有CuB區(qū)域，該區(qū)域包含有保守的5個(gè)H（His），一個(gè)F（Phe），二級(jí)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中所獲得的一年紫PnPPO1蛋白片段中含2個(gè)α-螺旋（含量10.27%），1個(gè)β-折疊（4.79%）串通不同長(zhǎng)度的無(wú)規(guī)則卷曲（84.93%）。

PPO是一種質(zhì)體酶，它在植物中的分布有兩個(gè)特點(diǎn)：一是常存在于光合組織和非光合質(zhì)體中，二是在植物的幼嫩部分含量比較高[6]。研究表明，在不同物種、組織和發(fā)育階段，PPO的表達(dá)水平存在較大差異[7]，如番茄中，該基因僅在葉片發(fā)育后期的柵欄細(xì)胞中表達(dá)，而蛋白主要存在于嫩葉、花、根形態(tài)建成等時(shí)期的表皮細(xì)胞中，隨著葉片的發(fā)育成熟，幾乎檢測(cè)不到該蛋白的存在[8]。在馬鈴薯中，該基因僅在頂端的四個(gè)葉節(jié)點(diǎn)上能檢測(cè)到表達(dá)，而其蛋白存在于所有的葉節(jié)點(diǎn)上。在蓮藕中，該基因在整個(gè)供試組織中都有表達(dá)，但在莖尖和幼葉中表達(dá)量最高，其次為新鮮的蓮藕切片，而在花瓣和莖稈中表達(dá)量最低[9]。本研究結(jié)果表明，一年紫中PnPPO1在葉芽中表達(dá)量最高，在鞭根中微量表達(dá)，而在其余組織中未檢測(cè)表達(dá)，推測(cè)PnPPO1先在葉芽中表達(dá)，然后再分配到各組織中，在特定的時(shí)空下被激活并擔(dān)負(fù)相應(yīng)的功能。

致謝：感謝浙江農(nóng)林大學(xué)特聘教授鄭康樂(lè)在實(shí)驗(yàn)和論文寫作中提出的寶貴建議和意見(jiàn)。

[1]王乃棟，張麗霞，向勤锃，等.茶樹多酚氧化酶基因的生物信息學(xué)分析及原核表達(dá)[J].茶葉科學(xué)，2011，31（1）：33－39.

[2]郭小勤，李犇，阮曉賽，等.用ACGM分子標(biāo)記研究10個(gè)毛竹不同栽培變種的遺傳多樣性[J].林業(yè)科學(xué)，2009，45（4）：28－32.

[3]楊杰，曹卿，王軍，等.水稻多酚氧化酶基因功能標(biāo)記的開發(fā)與應(yīng)用[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2011，25（1）：37－42.

[4]王曼玲，胡中立，周明全，等.植物多酚氧化酶的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22（2）：215－222.

[5]Mayer A M.Polyphenol oxidases in plants and fungi: Going places? A review[J].Phytochemistry, 2006，67（21）：18－31.

[6]SUN Youwei, HE Zhonghu, MA Wujun,et al.Alternative splicing in the coding region of Ppo-A1 directly influences the polyphenol oxidase activity in common wheat (Triticun aestivum L.) [J].Funct Integr Genomics, 2011, 11（1）：85－93.

[7]王弋，郭小勤，婁永峰，等.紫竹多酚氧化酶基因克隆及其表達(dá)[J].浙江林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27（5）：781－785.

[8]WANG Hong, JIANG Yuping, YU Haijing,et al.Light quality affects incidence of powdery mildew expression of defence-related genes and associated metabolism in cucumber plants[J].Eu J Plant Pathol，2010，127（1）：125－135.

[9]張躍進(jìn)，郝曉燕，梁宗鎖，等.郭宏波 藕多酚氧化酶基因（PPO）的克隆與表達(dá)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，19（4）：634－641.