江青東，王慧杰，陳 寧

（1.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校繼續(xù)教育學(xué)院，河南 鄭州450011；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆 烏魯木齊830000）

5－羥色胺（5－HT）是一種吲哚衍生物，分子式C10H12N2O。5－羥色胺能與酸作用生成結(jié)晶鹽 。其鹽酸鹽熔點(diǎn)167℃～168℃ ；苦味酸鹽熔點(diǎn)185℃～189℃。5－羥色胺在腦組織中的濃度較高，它是調(diào)節(jié)神經(jīng)活動(dòng)的一種重要物質(zhì)［1－2］。同時(shí)美國(guó)辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院的納爾遜·霍斯曼和其他研究人員發(fā)現(xiàn)，5－羥色胺會(huì)發(fā)出一種信號(hào)，降低奶牛的產(chǎn)奶量。只要抑制奶牛乳腺中的5－羥色胺含量，就可以將產(chǎn)奶量提高15%。其機(jī)理是乳腺上皮合成的5－HT抑制了PRL對(duì)乳腺的刺激，影響乳腺的發(fā)育和泌乳，抑制PRL刺激的乳蛋白基因表達(dá)，這些作用可被5－HTR拮抗劑二甲麥角新堿阻斷，提示是經(jīng)過5－HTR產(chǎn)生的［3－7］。目前，針對(duì)哺乳動(dòng)物5－HTR基因在乳腺組織中的分布尚未報(bào)道，本試驗(yàn)通過基因文庫電子拼接及RTPCR技術(shù)克隆了奶山羊乳腺組織中5－HTR7基因，為進(jìn)一步研究5－HT在其受體的作用下對(duì)哺乳動(dòng)物牛的乳腺發(fā)育和調(diào)控泌乳方面提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集 取泌乳期奶山羊（購自陜西薩能奶山羊養(yǎng)殖基地）乳腺組織，入液氮速凍，置－80℃保存保存待測(cè)。

1.2 酶與試劑 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、RNase－Inhibitor、Oligo（dT）、TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、Buffer、DNA Marker、pMD－19T 載 體、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞、T4DNA連接酶等，均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；動(dòng)物組織RNAout，購自綿陽天澤基因工程有限公司。

1.3 PCR引物的設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank公布的牛和鼠的5－HT受體－7基因的cDNA序列，利用Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件和BLAST鑒定設(shè)計(jì)一對(duì)克隆引物。上游引物：5′－TCCTGACGCTCATCACGCTGCTG－3′，下游引物：5′－GAGAGAGTTTGCATAGCCCAGCCA －3′，預(yù)期片段810bp，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物科學(xué)技術(shù)有限公司合成。

1.4 奶山羊乳腺組織總RNA的提取及含量測(cè)定按照動(dòng)物組織RNAout試劑盒的說明進(jìn)行提取乳腺組織總RNA：取0.1g乳腺組織，采用動(dòng)物組織RNAout提取總RNA，溶解于20μL DEPC水中；取5 μL乳腺組織RNA提取液（其余－80℃保存?zhèn)溆茫?，?.8%瓊脂糖凝膠電泳（130V，15min），紫外燈下觀察，檢查其完整性。紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD260和OD280，檢測(cè)RNA的純度及計(jì)算含量（圖1）。

圖1 乳腺組織中總RNA電泳結(jié)果

1.5 RT－PCR法 cDNA合成反應(yīng)體系：模板RNA 2μL，5×Buffer 4μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）4μL，RNase Inhibitor（40U/μL）0.5μL，Oligo（dT）18（50 pmol/L）1μL，AMV（5U/μL）0.5μL，DEPC－H2O 6 μL，總體積20μL?；靹?，室溫放置10min，入42℃1 h，置－20℃冰箱備用。

PCR擴(kuò)增體系：10×Buffer（Mg2＋）5μL，dNTP Mix（2.5mmol/L）6μL，25mmol/L MgCl26μL，rTaq（5U/μL）0.5μL，上、下游引物（20pmol/L）各1μL，cDNA 4μL，ddH2O 14μL，總體積50μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃變性5min；95℃10s，52℃20s，72℃30s，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)完成，分別取5μL PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠、100V、30min電泳。凝膠成像系統(tǒng)照像并檢測(cè)PCR產(chǎn)物積分光密度（IOD）值，用各基因與β－actin的比值相對(duì)定量轉(zhuǎn)錄水平。

PCR產(chǎn)物回收：目的片斷的回收參照上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司UNIQ－10膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。

目的基因的克隆與測(cè)序：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，與pMD－19T載體連接，構(gòu)建克隆載體。轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，重組質(zhì)粒通過酶切和PCR鑒定：1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果；陽性菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.6 序列分析 利用BioXM 2.6、DNAStar軟件及Blast、Smart進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT－PCR擴(kuò)增及克隆 RT－PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到了長(zhǎng)度為810bp的目的片段（圖2）。菌落PCR鑒定得到同樣大小的目的片段（圖3）。

2.2 奶山羊5－HTR7基因的克隆序列 測(cè)序結(jié)果及推測(cè)的氨基酸序列如圖4?？寺〉哪躺窖?－HTR7基因包含一個(gè)完整的開放閱讀框架（open reading frame，ORF），長(zhǎng)為810bp，酸性氨基酸：46個(gè)；堿性氨基酸：70個(gè)；蛋白質(zhì)分子量為：42.20 kDa，等電點(diǎn)：11.773。

圖4 奶山羊5－HTR7的cDNA序列及其推測(cè)的氨基酸序列

2.3 奶山羊5－HTR7基因的種屬差異分析DNAStar分析發(fā)現(xiàn)，奶山羊5－HTR7基因的ORF與猴（NM－00193683）、大熊貓（XM－002926833）、豬（NM－214101）、大 猩 猩 （ABO37534）和 人 （NM－000866）的同源性分別為21.3%、19.8%、20.7%、89.2%和76.2%（圖5），推測(cè)氨基酸序列與人和大猩猩在基因進(jìn)化方面可見，羊和人的同源性最高，其次是與人。Blastp序列比較分析，奶山羊5－HTR7基因推測(cè)氨基酸序列與人和大猩猩的同源性（Identities）分別為73%和64%，相似性（Positives）分別為81%和69%；Smart分析發(fā)現(xiàn)，奶山羊5－HTR7基因推測(cè)氨基酸序列信號(hào)肽與人、牛5－HTR7基因氨基酸序列信號(hào)肽均為1aa～17aa，SapB結(jié)構(gòu)域均為59aa～126aa，結(jié)構(gòu)特征與人、牛的5－HTR7結(jié)構(gòu)特征相一致。這也許就是5－HTR7基因起重要生物學(xué)作用的蛋白片段，而這需要進(jìn)一步的深入研究。

圖5 奶山羊5－HTR7基因序列與猴、大熊貓、大猩猩和人5－HTR7基因序列的比較

3 討論

5－HT分布全身，尤其在血小板和腸內(nèi)更多，腦內(nèi)主要是在中縫核及延腦中。迄今為止已發(fā)現(xiàn)人類5－HT受體至少有7大類，這7種類型又可進(jìn)一步分成若干亞型［8－11］。按照受體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式的不同，可分為G蛋白偶聯(lián)體超家族和配體門控離子通道族兩大類。5－HT7受體的結(jié)構(gòu)類似于5－HT6，有7個(gè)疏水的跨膜區(qū)，但含有一些保守性結(jié)構(gòu)，有1個(gè)內(nèi)含子，第5個(gè)跨膜區(qū)有保守的單丙氨酸殘基。5－HT7在大腦中有著廣泛的分布，在冠狀動(dòng)脈、胃腸道系統(tǒng)等周圍組織中也很豐富［12］。目前5－HT受體激動(dòng)劑和抑制劑都是用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，治療精神疾?。?3－14］。況且沒有專門針對(duì)5－HT 受體的藥物，將這些化學(xué)藥物用于奶牛，一是會(huì)影響奶牛的健康，最重要的是這些化合物會(huì)在奶里殘留，進(jìn)而影響人的健康。本試驗(yàn)通過牛和鼠在其他組織中的5－HTR7基因序列設(shè)計(jì)同源性引物采用RT－PCR方法克隆出奶山羊乳腺組織中5－HTR7的基因組全序列，據(jù)報(bào)道，5－HT在乳腺組織中主要與5－HTR7相互作用來影響哺乳動(dòng)物的泌乳量，這將對(duì)下一步研究特異性針對(duì)乳腺中的5－HT受體，通過基因敲除技術(shù)，是一種綠色環(huán)保的藥物，來提高哺乳動(dòng)物的產(chǎn)奶量和養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益奠定理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

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