肖 海，楊洪毅，張照婧，張言鵬，李曉文#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 4500523)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450052

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型22(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22，PTPN22)基因編碼淋巴細(xì)胞特異性的蛋白酪氨酸磷酸酶(lymphoid tyrosine phosphatase, LYP)，在T細(xì)胞活化的信號(hào)傳導(dǎo)中起著重要的負(fù)調(diào)節(jié)作用[1]。作者應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測(cè)PTPN22基因rs33996649和rs2488457位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)，探討二者與河南漢族人群肺結(jié)核(pulmonary tuberculosis，TB)形成之間的關(guān)系，以期為T(mén)B的發(fā)病機(jī)制及治療診斷提供數(shù)據(jù)和參考。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象病例組：214例初診TB患者來(lái)自2010年至2012年河南安陽(yáng)、新鄉(xiāng)、新密等地傳染病醫(yī)院的住院患者，其中男128例，女86例，年齡20～56(38.9±17.6)歲，TB的診斷符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部通告[2008]2號(hào)文件的WS 288-2008 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除糖尿病、HIV感染、使用腎上腺皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑者。正常對(duì)照205例，其中男141例，女性64例，年齡20～52(36.0±15.7)歲，為同期體檢的健康個(gè)體。以上研究對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系，并均得到本人或監(jiān)護(hù)人知情同意。

1.2PTPN22基因rs33996649與rs2488457位點(diǎn)的多態(tài)性檢測(cè)采用PCR-RFLP法。抽取研究對(duì)象的靜脈血3 mL，EDTA抗凝，酚/氯仿法提取基因組DNA。引物序列均來(lái)源于GeneBank，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。PCR反應(yīng)體系：樣本DNA 2 μL，Mix(含染料)10 μL，上、下游引物各1 μL，補(bǔ)充去離子水至20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 25 s，72℃ 30 s，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，加相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶5 U，10×緩沖液2 μL，加去離子水補(bǔ)充體系到20 μL。rs33996649用MspⅠ消化，37 ℃水浴2 h，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳40 min；rs2488457用SacⅠ消化，37 ℃水浴3 h，35 g/L瓊脂糖凝膠電泳60 min。凝膠成像分析儀上觀察并分析結(jié)果，照相保存。

表1 rs33996649和rs2488457擴(kuò)增引物及片段大小

1.3基因型判讀rs33996649位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小234 bp，經(jīng)MspⅠ消化后有3種基因型：C/C(143，91 bp)，G/G(234 bp)，G/C(234，143，91 bp)。rs2488457位點(diǎn)擴(kuò)增片段大小為203 bp，經(jīng)內(nèi)切酶SacⅠ消化后基因型：C/C(181，22 bp)，G/G(203 bp)，G/C(203，181，22 bp)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0處理數(shù)據(jù)。對(duì)2組PTPN22基因兩位點(diǎn)的基因型分布行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)比較2組間基因型頻率和等位基因頻率的差異，并計(jì)算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)[2]。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

205 例正常人 和214例TB患者中rs33996649位點(diǎn)全部為C/C基因型，電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。隨機(jī)抽取3例樣本進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與電泳結(jié)果一致。

圖1 rs33996649PCR-RT-LP產(chǎn)物電泳圖

rs2488457位點(diǎn)檢測(cè)到2種基因和3種基因型(圖2)，對(duì)照組基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(χ2=3.501，P=0.061)。病例組和對(duì)照組等位基因頻率及基因型頻率分布組間見(jiàn)表2。

圖2 rs2488457 PCR-RFLP 產(chǎn)物電泳圖

1～4、7～10、14：G/C基因型；5、11～13：C/C基因型；6：G/G基因型;M:Marker。

表2 2組rs2488457位點(diǎn)基因型頻率和基因頻率的比較 例(%)

3 討論

TB是由結(jié)核分枝桿菌引起的傳染性疾病，是單一病原體致死人數(shù)最多的疾病，給人類(lèi)的生命和健康構(gòu)成了極大的威脅[3]，其發(fā)病是復(fù)雜的多因素綜合作用的結(jié)果，影響因素不僅包括感染結(jié)核桿菌、環(huán)境因素，還涉及宿主的遺傳易感性。基因多態(tài)性位點(diǎn)可引起蛋白結(jié)構(gòu)和功能上的改變，導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染者的不同轉(zhuǎn)歸，即不同個(gè)體對(duì)TB表現(xiàn)出不同的易感性。

PTPs是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要調(diào)節(jié)因子,參與多種細(xì)胞功能的調(diào)控[4]。PTPN22定位于1p13.2，編碼的LYP 通過(guò)C端富含脯氨酸的基序與蛋白酪氨酸激酶連接從而抑制T細(xì)胞活化[5]。一旦PTPN22基因發(fā)生變異，LYP的功能或表達(dá)量會(huì)發(fā)生改變，從而引起T細(xì)胞信號(hào)引導(dǎo)障礙，導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[6]。

rs2488457位于PTPN22啟動(dòng)子序列，該位點(diǎn)變異直接影響LYP的編碼。Taniyama等[7]稱在日本人群、朝鮮族人群和高加索人群中rs2488457位點(diǎn)的多態(tài)性和Ⅰ型糖尿病易感性有關(guān)。Huang等[8]對(duì)廣東人群的研究發(fā)現(xiàn),rs2488457位點(diǎn)多態(tài)性與類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎易感性有關(guān)。該研究顯示河南漢族人群中TB患者中rs2488457的G/G基因型頻率高于正常人，提示rs2488457的G/G基因型與河南漢族人群TB的發(fā)生有一定的關(guān)系。

rs33996649 位于第10外顯子LYP 的催化結(jié)構(gòu)域，該位點(diǎn)變異促使編碼的多肽鏈的263位氨基酸殘基由精氨酸轉(zhuǎn)變成谷氨酰胺。 在單細(xì)胞水平上，Q263 對(duì) TCR 信號(hào)通路蛋白去磷酸化的作用效率比野生型 R263 低，表明 Q263 是一種喪失功能型的變異，而且 LYP 的這種催化效率降低主要是由于催化結(jié)構(gòu)域的改變導(dǎo)致[9]。Lamsyah等[10]研究發(fā)現(xiàn)rs33996649與摩洛哥人群的TB易感性有關(guān)，并且有報(bào)告[11]稱該位點(diǎn)與北美人群、西班牙人群、挪威人群的自身免疫性疾病有關(guān)，但Huang等[8]發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在廣東人群中沒(méi)有多態(tài)性，作者在河南漢族人群中也未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性，表明其多態(tài)性存在種族差異。PTPN22基因編碼的LYP蛋白在免疫細(xì)胞中的重要調(diào)節(jié)作用，因此有必要在中國(guó)人群中進(jìn)一步尋找新的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)并探討其與TB的相關(guān)性。

[1] Obiri DD, Flink N, Maier JV, et al. PEST-domain-enriched tyrosine phosphatase and glucocorticoids as regulators of anaphylaxis in mice[J]. Allergy, 2012，67(2): 175

[2] Shi YY, He L. SHEsis, a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci[J]. Cell Res, 2005, 15(2): 97

[3] North RJ,Jung YJ. Immunity to tuberculosis[J]. Annu Rev Immunol, 2004, 22: 599

[4] 李婉南,姜軼群,范曉迪,等.蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶及相關(guān)疾病[J]. 吉林大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版, 2008，34(6): 1106

[5] Cohen S, Dadi H, Shaoul E, et al. Cloning and characterization of a lymphoid-specific, inducible human protein tyrosine phosphatase, Lyp[J]. Blood, 1999, 93(6): 2013

[6] Ray D, Tomar N, Gupta N, et al. Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 22 (PTPN22) gene R620W variant and sporadic idiopathic hypoparathyroidism in Asian Indians[J]. Int J Immunogenet, 2006,33(4): 237

[7] Taniyama M, Maruyama T, Tozaki T, et al. Association of PTPN22 haplotypes with type 1 diabetes in the Japanese population[J]. Hum Immunol, 2010,71(8): 795

[8] Huang JJ, Qiu YR, Li HX, et al. A PTPN22 promoter polymorphism-1123G>C is associated with RA pathogenesis in Chinese[J]. Rheumatol Int, 2012,32(3): 767

[9] Orru V, Tsai SJ, Rueda B, et al. A loss-of-function variant of PTPN22 is associated with reduced risk of systemic lupus erythematosus[J]. Hum Mol Genet, 2009, 18(3): 569

[10]Lamsyah H, Rueda B, Baassi L, et al. Association of PTPN22 gene functional variants with development of pulmonary tuberculosis in Moroccan population[J]. Tissue Antigens, 2009,74(3): 228

[11]Skinningsrud B, Husebye ES, Gervin K, et al. Mutation screening of PTPN22: association of the 1858T-allele with Addison's disease[J]. Eur J Hum Genet, 2008, 16(8): 977