趙 虹 駱慶和 殷 明 趙文娟 (上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240)

阿爾茨海默(AD)患者的迅速增加是當前社會面臨的巨大挑戰(zhàn)，故對AD病理機制的研究及開發(fā)有效的治療方法已成為了目前神經(jīng)退行性疾病研究的熱點和重點。AD主要病理特征為大腦萎縮，在腦膜、大腦皮層及海馬的血管壁內(nèi)見有β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積形成的老年斑(SP)〔1〕、神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)及神經(jīng)元丟失〔2〕。大量研究表明，Aβ沉積和tau蛋白的NFTs在AD發(fā)病中起關(guān)鍵作用。海馬和大腦皮層區(qū)細胞外Aβ的聚集及細胞內(nèi)高磷酸化tau蛋白的神經(jīng)纖維樣纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞的死亡，從而引發(fā)病人漸進性認知障礙及記憶喪失。神經(jīng)元的喪失主要見于額，頂，大腦皮層。此處神經(jīng)元的喪失導(dǎo)致乙酰膽堿含量減少和膽堿乙?；钚缘臏p低，導(dǎo)致出現(xiàn)記憶和認知功能障礙等臨床表現(xiàn)〔3〕。AD的病因和病理生理機制十分復(fù)雜，受基因調(diào)控和多種環(huán)境因素影響，目前AD的發(fā)病機制尚不能完全闡明，也無有效治療方法。關(guān)于AD有許多假說，包括膽堿能假說，amyloid級聯(lián)反應(yīng)，氧化應(yīng)激學(xué)說等等。氧化應(yīng)激與AD有著密切的關(guān)系，AD的病因?qū)W中，其理論之一就是氧化應(yīng)激學(xué)說。所以本文主要針對AD的氧化應(yīng)激學(xué)說，闡述氧化應(yīng)激與AD的病理特征關(guān)系以及可能的作用，并提出關(guān)于氧化應(yīng)激的一些指標的評價指標，從而對氧化應(yīng)激以及AD有更深的了解。

1 氧化應(yīng)激與自由基

氧化應(yīng)激(OS)的概念最早源于人類對衰老的認識。1956年，英國學(xué)者Harmna首次提出自由基衰老學(xué)說，該學(xué)說認為自由基攻擊生命大分子造成組織細胞損傷，是引起機體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因。1990年，美國衰老研究權(quán)威Sohal教授指出了自由基衰老學(xué)說的種種缺陷，并首先提出了氧化應(yīng)激的概念。

自由基在某些生理生化過程發(fā)揮作用，在生理狀態(tài)下的自由基能夠刺激細胞生長。但是當自由基的產(chǎn)生和清除的平衡狀態(tài)被破壞，導(dǎo)致自由基大量聚集，濃度過高會引起人體脂質(zhì)過氧化以及蛋白質(zhì)變性，從而對機體造成氧化損傷，形成各種不良結(jié)果，對人體造成危害〔4〕。

人體的腦組織是機體負荷氧最多的器官之一。雖然大腦的重量只占據(jù)人體體重的2% ～3%，但是消耗了供應(yīng)機體的20%的氧〔5〕。大腦神經(jīng)元的谷胱甘肽含量較少，而且只含有中等量的抗氧化酶，清除自由基的能力相對較弱〔6〕;大腦的神經(jīng)元的膜結(jié)構(gòu)是由高濃度的不飽和脂肪酸組成的，極易被氧化。此外，血腦屏障的存在阻礙了部分抗氧化物質(zhì)，使其不容易透過，因而使得人腦對氧化應(yīng)激特別敏感〔7〕。氧是人類生存必需的元素，但如果體內(nèi)氧化還原平衡遭到破壞，多余的氧自由基會對身體造成氧化損傷，此類氧化損傷直接參與了老年癡呆癥等多種神經(jīng)退行性疾病的病理過程。

2 OS與AD的病理特征

2.1 Aβ與OS效應(yīng) Aβ是SP的主要成分，是由β-淀粉樣多肽聚集于神經(jīng)軸突而形成。β淀粉樣多肽來源于一種跨膜蛋白-淀粉樣前體蛋白，非聚集的β淀粉樣多肽對人體沒有損傷作用，但是當它形成富集狀態(tài)之后，便會產(chǎn)生神經(jīng)毒性和血管內(nèi)皮毒性，能夠誘導(dǎo)OS。近年研究發(fā)現(xiàn)，Aβ的毒性作用與自由基有關(guān)，OS參與了Aβ致神經(jīng)毒性的調(diào)節(jié)〔8〕。

Aβ神經(jīng)毒性可以造成細胞膜損傷。Aβ誘導(dǎo) OS，產(chǎn)生ROS，引起細胞膜上不飽和脂肪酸的過氧化，產(chǎn)生過氧化物質(zhì)，如丙二醛等。這些過氧化脂質(zhì)體能夠進一步破壞膜蛋白的功能。最直接反應(yīng)在過氧化脂質(zhì)體能夠改變細胞膜上磷脂的結(jié)構(gòu)，從而改變了細胞膜的流動性。

2.2 tau蛋白的氧化磷酸化與OS效應(yīng) NFTS是AD最主要的病理特征之一，它主要是由tau蛋白氧化磷酸化所形成〔9〕。tau蛋白是一種微管組織相關(guān)蛋白，它與微管結(jié)合的能力會由于高度磷酸化而消失，從而形成神經(jīng)纖維纏結(jié)導(dǎo)致神經(jīng)元功能的喪失。而OS與tau的高度磷酸化有密切聯(lián)系。ROS能夠使鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)，鈣離子大量內(nèi)流使鈣離子依賴性蛋白激酶以及鈣調(diào)蛋白激酶過度活化，造成蛋白磷酸酶與蛋白激酶的比例失衡，從而促進tau蛋白異常磷酸化〔10〕。此外，ROS也可以通過抑制能量代謝使糖原合成激酶-3(GSK-3)代償性激活，而tau蛋白激酶(TPK)是GSK-3的異構(gòu)體，從而也促進了tau蛋白的磷酸化〔11〕。

3 OS狀態(tài)的表征

在生理條件下，ROS主要來源于線粒體內(nèi)的氧化磷酸化〔12〕。自由基的產(chǎn)生會對機體的脂質(zhì)，蛋白，DNA等生物大分子造成氧化損傷，因此生物體內(nèi)OS代謝產(chǎn)物的檢測，對于OS狀態(tài)的表征具有極大的意義。

機體代謝過程中，ROS不斷通過非酶促反應(yīng)和酶促反應(yīng)產(chǎn)生，但在抗氧化酶以及外源性和內(nèi)源性抗氧化劑的協(xié)同作用下被不斷清除，自由基的產(chǎn)生與消除處于動態(tài)平衡過程，可以維持在一個正常的水平之下。細胞內(nèi)氧化還原平衡是受到嚴格控制的，即便在老年癡呆癥的病態(tài)環(huán)境下，面臨ROS可能造成的損傷，細胞會發(fā)生相應(yīng)的抗氧化反應(yīng)，這些抗氧化因素的顯著改變也可以作為 OS發(fā)生的標志〔13，14〕。

3.1 脂質(zhì)過氧化物 生物膜脂質(zhì)的磷脂中含有大量多不飽和脂肪酸(PUFA)，在ROS的作用下，引發(fā)脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，同時在脂質(zhì)反應(yīng)中產(chǎn)生的LOO·也會引發(fā)鏈式反應(yīng)〔15〕，從而產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，在AD病人腦內(nèi)，特別是NFTS中發(fā)現(xiàn)大量的OS產(chǎn)物丙二醛(MDA)等〔16〕。丙二醛是脂質(zhì)過氧化物的裂解產(chǎn)物，其毒性較大，與衰老密切相關(guān)。MDA的生成量與脂質(zhì)過氧化程度相關(guān)，故可作為一個檢測脂質(zhì)過氧化的指標。AD患者腦內(nèi)的脂質(zhì)過氧化物如，4-羥基壬烯酸(4-HNE)，丙醛等。盡管脂質(zhì)過氧化物可以通過檢測MDA含量定量測定，實驗中一般使用TBARS法，但是由于該方法不具有特異性，所以得到的結(jié)果并不準確。相比之下，4-HNE比MDA更能反映AD患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)，可以通過HPLC或者GC/MS測定〔17〕。

但是對于脂質(zhì)過氧化物的檢測，多數(shù)通過解剖取得相關(guān)腦組織再進行試驗，因此如果能找到活體檢測方法表征氧化應(yīng)激的狀態(tài)就更理想了。磷脂分子中的PUFA氧化形成的過氧化物可以被水解成 F2-和 D2/E2-isoprostanes(IP)。Morrow等〔18〕人的研究發(fā)現(xiàn)AD病人腦脊液和腦室液中F2-IsoP水平顯著高于正常人。大量實驗證明測量IP的含量對于活體無創(chuàng)檢測脂質(zhì)過氧化水平有很好的應(yīng)用前景。

3.2 蛋白氧化產(chǎn)物 細胞內(nèi)外富含大量蛋白質(zhì)，極易受到活性氧的攻擊使蛋白質(zhì)發(fā)生變化。ROS能夠氧化氨基酸殘基側(cè)鏈生成酮類或醛類衍生物。一些氨基酸諸如組氨酸，精氨酸，賴氨酸等很容易被氧化產(chǎn)生蛋白羰基衍生物〔19〕。Moreira等〔20〕研究發(fā)現(xiàn)，羰基是蛋白氧化產(chǎn)物，AD患者腦內(nèi)也出現(xiàn)蛋白羰基水平增高。蛋白羰基衍生物具有較高的穩(wěn)定性，且在氧化應(yīng)激過程中形成很早，故可以通過測定羰基的含量作為判斷蛋白質(zhì)氧化程度的指標。大多數(shù)檢測蛋白羰基衍生物的方法都是基于羰基鏈與DNPH反應(yīng)，再通過特定的DNP抗體進行檢測〔21〕。

EPR電磁自旋共振法(也可以稱作ESR)也可以用于蛋白氧化的檢測。其原理是 2，2，6，6-tetramethyl-4-maleimido-piperidine-1-oxyl(MAL-6)〔22〕能夠與半胱氨酸的-SH基團共價結(jié)合形成特異性的EPR光譜，用以評價結(jié)構(gòu)信息。EPR光譜能夠反映至少MAL-6與膜蛋白結(jié)合的兩個位點，分為較強S和較弱W。構(gòu)象的改變或蛋白間作用力的增強會導(dǎo)致W/S比例變小?！H通過Fenton反應(yīng)與膜蛋白作用也會導(dǎo)致W/S比例的下降，表明蛋白之間作用力增強〔23〕，從而表征蛋白氧化程度。趙保路〔24〕利用ESR方法，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層中活性氧含量升高。

3.3 DNA氧化產(chǎn)物 自由基能夠引起自由基損傷，其中最主要是·OH，它能夠攻擊脫氧核糖，使磷酸二酯鍵斷裂，造成DNA單鏈或者雙鏈斷裂，可以通過堿性洗脫法測定。此外，自由基還會導(dǎo)致DNA蛋白交聯(lián)，亦或是產(chǎn)生堿基修飾物，例如脫氧鳥苷被氧化產(chǎn)生堿基修飾物8-脫氧鳥苷(8-OHdG)。8-OHdG是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物，已經(jīng)被公認為最能夠反應(yīng)機體DNA氧化損傷的理想生物指標，在氧化應(yīng)激領(lǐng)域內(nèi)被廣泛采用。8-OHdG的形成可誘導(dǎo)損傷位點及鄰近堿基非特異性配對和錯讀，其中以 GC-TA置換為主〔25〕，其含量可以通過HPLC或者GC/MS方法測定。

畢勝等〔26〕人的研究中用HPLC測量8-OHdG含量，發(fā)現(xiàn)AD病人的淋巴細胞內(nèi)8-OHdG基礎(chǔ)含量顯著高于對照組。朱紅敏等〔27〕用酶聯(lián)免疫吸附試驗的方法測定AD患者和正常人血漿中8-OHdG的水平，發(fā)現(xiàn)AD病人血漿中8-OHdG水平較正常組增高。

3.4 抗氧化物質(zhì) 機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度具有密切聯(lián)系，該防御體系有酶促與非酶促兩個體系，許多酶是以微量元素為活性中心，例如:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)等，非酶促反應(yīng)體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質(zhì)。例如:VE、胡蘿卜素、VC、半胱氨酸、色氨酸、銅蘭蛋白、乳鐵蛋白等。Grundman〔28〕的實驗發(fā)現(xiàn)大量維生素E能夠延緩腦功能障礙的產(chǎn)生。這個體系的防護氧化作用主要通過三條途徑:①消除自由基和活性氧以免引發(fā)脂質(zhì)過氧化;②分解過氧化物，阻斷過氧化鏈;③出去起催化作用的金屬離子。防御體系各成分之間相互起到了協(xié)同作用，以及代償作用與依賴作用。

單獨測定某一種或者某些抗氧化成分的含量往往不能全面反映組織的抗氧化能力，且有時在操作上難度較高，也較為繁瑣，因此可以測量組織中總抗氧化能力來評價機體總體上的抗氧化活性，這比測量已知的每一種抗氧化劑或者某個自由基含量更為有效和有說服力〔15〕。

4 結(jié)語

隨著世界人口老齡化，AD在老年人的疾病譜中已占據(jù)十分突出的位置，并成為嚴重威脅老年人健康的四大疾病之一。我國人口老化速度居世界各國之首，AD發(fā)病率呈現(xiàn)上升勢頭，流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國每年有近百萬新發(fā)病例，AD已成為困擾老年人生活質(zhì)量、給家庭和社會帶來沉重經(jīng)濟負擔的常見疾病。許多證據(jù)表明OS與AD具有密切關(guān)系，但現(xiàn)在尚不完全清除究竟OS是AD的發(fā)病原因還是產(chǎn)生疾病之后的結(jié)果，OS是否是AD中最關(guān)鍵的原因仍有待進一步的實驗證明。由于自由基很不穩(wěn)定，因此尋找敏感、具有特異性、操作簡便的方法以及建立完善的評價體系對檢測生物體內(nèi)的自由基水平非常迫切。對于患有AD的患者來說，不斷嘗試通過減少OS進行治療應(yīng)該是可行的〔29〕。相信對AD的深入研究有助于人們更清楚了解該機病的發(fā)病機制，從而找出更有效的治療方法。

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