郭園園，魯曉翔，李江闊，梁冰，郭興月，陳紹慧，張鵬

1(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津，300134)

2(國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津，300384)

3(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽，110866)

核桃(Juglans regiaL.)又稱胡桃、羌桃。核桃種仁富含蛋白質(zhì)、磷脂、維生素、礦物質(zhì)及人體必需的不飽和脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有滋養(yǎng)腦細胞，增強腦功能，防止動脈硬化，降低膽固醇等作用［1］。近年來，鮮食核桃因其營養(yǎng)豐富、口感良好、相對較低的脂肪含量等，在國內(nèi)外越來越受到人們的喜愛［2］。但青皮核桃采后呼吸旺盛，貯藏時極易腐爛，影響其市場供應(yīng)期［3］。因此，青皮核桃的保鮮技術(shù)亟待解決。

目前，利用保鮮劑保鮮青皮核桃的研究尚未見報道。納他霉素是一種天然保鮮劑，安全性高，且具有廣譜高效的抗真菌作用［4］。據(jù)報道［5－6］，納他霉素在低濃度下就能有效抑制真菌生長，對幾乎所有的真菌類都有很強的抑制性，已在香菇、乳制品、肉制品、果汁飲料、葡萄酒保藏上得到應(yīng)用，效果較好。本實驗利用納他霉素對青皮核桃進行處理，研究其對青皮核桃品質(zhì)變化的影響，以探討青皮核桃的貯藏保鮮提供新的技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料:2012年9月2日采自北京平谷縣核桃實驗園基地，選取大小均勻、無機械損傷、無病蟲害的青皮核桃供實驗用。

主要試劑:納他霉素，北京東方瑞德生物技術(shù)公司;三氯乙酸(分析純)，天津市江天化工技術(shù)有限公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉(均為分析純)，天津市科威有限公司;鄰苯二酚(為分析純)，天津市光復(fù)精細化工研究所;PVP、DTT(均為分析純)，天津博美科生物技術(shù)有限公司;亞油酸鈉、Tri tonX-100(生化試劑)，天津博美科生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷庫:國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)(以下簡稱保鮮中心)，庫內(nèi)溫度 －0.5～0.5℃;CW-700d分光測色計，柯尼卡美能達(中國)投資有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SIGMA 3－30K高速離心機，德國SIGMA實驗室離心機公司;微孔保鮮袋(厚度0.02 mm)由保鮮中心提供。

1.3 實驗材料預(yù)處理

(1)對照組(CK):將選取的青皮核桃于冷庫［(0±0.5)℃］中進行預(yù)冷處理，充分預(yù)冷24 h后，用微孔袋(厚度0.02 mm)包裝后放入紙箱，繼續(xù)冷藏。

(2)處理組1(SY1):將選取的青皮核桃在質(zhì)量分數(shù)為600 mg∕L的納他霉素中浸泡3 min，瀝干后于冷庫［(0±0.5)℃］中預(yù)冷24h后，用微孔袋(厚度0.02 mm)包裝后放入紙箱，繼續(xù)冷藏。

(3)處理組2(SY2):將選取的青皮核桃在質(zhì)量分數(shù)為800 mg∕L的納他霉素中浸泡3 min，余下步驟同SY1處。

(4)處理組3(SY3):將選取的青皮核桃在質(zhì)量分數(shù)為1 000 mg∕L的納他霉素中浸泡3 min，余下步驟同SY1處。

上述各處理組按10 kg/箱包裝，且每隔15d測定一次各項指標，每個處理各進行3次重復(fù)測定。

1.4 測定指標和方法

1.4.1 霉腐率

霉腐率/%=(霉爛果個數(shù)/處理的總果數(shù))×100

1.4.2 色差的測定

隨機取5個青皮核桃用CW－700 d分光測色計測定。測定時在果實對稱的位置用記號筆標記，每隔15 d對標記點進行測定，并取平均值。a*為負值，表示綠色。

1.4.3 丙二醛(MDA)含量測定

采用硫代巴比妥酸比色法［7］。

1.4.4 多酚氧化酶(PPO)

采用兒茶酚比色法［8］。

稱取核桃仁凍樣3 g于預(yù)冷的研缽中，加入適量0.05 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液(總用量20 mL)，冰浴研磨成勻漿，于4℃下15 000 r/min離心10 min，再取上清液于4℃下10 000 r/min離心10 min。取3 mL上清酶液，然后加入3.9 mL pH 7.8磷酸緩沖液，1.0 mL 0.1 mol/L兒茶酚，于37℃水浴保溫10 min，迅速放入冰浴中，立即加入2mL體積分數(shù)20﹪三氯乙酸終止反應(yīng)，于420 nm處測其吸光度值，以磷酸緩沖液代替酶液為對照調(diào)零。

1.4.5 過氧化氫酶(CAT)采用紫外吸收法［9］

稱取核桃仁凍樣0.2 g于預(yù)冷的研缽中，加入20 mL預(yù)冷后的pH 7.5、0.05 mol/L的磷酸緩沖液(內(nèi)含0.005 mol/L二硫蘇糖醇和2%PVP)，在冰浴中研磨成勻漿，于4℃下15 000 r/min離心 20 min，取0.05 mL粗酶液，加入3 mL 0.02 mol/L H2O2后，在240 nm處測定2 min內(nèi)樣品的吸光度變化。

1.4.6 脂氧合酶(LOX)參考陳昆松［10］的方法測定

稱取核桃仁凍樣1.0 g，冰浴研磨，加入0.05mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)，并使最終體積為20 mL，于4℃下15 000 r/min離心30 min，上清液為LOX的提取液。加入亞油酸鈉25 μL，pH 7.0磷酸緩沖液2.775mL，30℃溫育，加 200 μL 酶液后 20 s開始計時，記錄234 nm處測定1 min內(nèi)吸光度，重復(fù)3次。

以上酶活性計算公式均為:

式中:X為酶的比活力(0.01ΔA/［g(FW)min］;△A為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化;D為稀釋倍數(shù)即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液體積的倍數(shù);t為反應(yīng)時間/min;m為稱取果肉質(zhì)量/g。

1.4.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用 Excel 2003軟件處理，并采用SPSS16.0軟件的新復(fù)極差法(Duncan)進行方差分析(P=0.05)和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 納他霉素對青皮核桃霉腐率的影響

圖1表明，各組核桃的霉腐率隨貯藏期的延長而增加。CK到貯藏60 d后霉腐率迅速增加，而各處理組在75d時霉腐率才大幅增加，而此時CK的霉腐率已達到48.18%，果實嚴重腐爛、發(fā)霉，已失去商品價值;而處理組在貯藏75d時的霉腐率依 SY1、SY2、SY3分別為23.69%、9.75%、6.73%。在整個貯藏期，霉腐率大小順序為CK＞SY1＞SY2＞SY3。從貯藏第15天開始，CK的青皮核桃霉腐率顯著(P＜0.05)高于處理組;SY3的霉腐率略低于SY2，但極顯著(P＜0.01)低于SY1。由此可知，納他霉素處理組有效地抑制了青皮核桃的霉變及腐爛，能更好地保持青皮核桃的品質(zhì)，其中以SY3的防霉效果最好。

圖1 納他霉素對青皮核桃霉腐率的影響Fig.1 Effect of natamycin on decay rate of green juglans

2.2 納他霉素對青皮核桃色差的影響

青皮核桃果皮色澤是評價其外觀品質(zhì)的重要指標。通常，青皮核桃的果皮在貯藏開始時為綠色，隨著貯藏時間的延長，果皮逐漸變黃，最后變?yōu)楹诤稚?。本試驗以色差計對青皮核桃的果皮色澤變化進行跟蹤監(jiān)測，其中a*正值表示偏紅，負值表示偏綠。a*值越小則表明顏色越綠。實驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可見，各組a*隨著貯藏時間的延長均呈上升趨勢，但各組青皮核桃的a*在貯藏前期差異并不明顯。至貯藏30 d，各組a*開始迅速增大。在貯藏60 d時，CK組的a*值達到4.39，極顯著(P＜0.01)高于處理組，但各處理組間無顯著差異。至貯藏后期，各組青皮核桃的a*變化趨于緩慢。在整個貯藏過程中，各組a*的大小順序為CK＞SY1＞SY2＞SY3?？芍?，納他霉素處理組能夠有效抑制a*值的增加，較好保持青皮核桃的色澤，其中以SY3的保色效果最好。

圖2 納他霉素對青皮核桃a*的影響Fig.2 Effect of natamycin on a*of green juglans

2.3 納他霉素對青皮核桃MDA的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，其含量的增加是膜脂過氧化加強，膜受傷而加劇衰老的表現(xiàn)，它反映了果實在逆境下受傷害的程度［11］。

圖3 納他霉素對青皮核桃MDA含量的影響Fig.3 Effect of natamycin on MDA content of green juglans

圖3顯示，各組的MDA含量的變化均為先增后降的趨勢，且有雙峰曲線。各組在貯藏15d時均出現(xiàn)第 1 個高峰，CK、SY1、SY2、SY3 的峰值分別為5.39%、5.18%、4.47%、4.06%，可能是因為青皮核桃對低溫的應(yīng)對反應(yīng)所致;之后由于青皮核桃適應(yīng)了貯藏溫度，而使MDA含量逐漸降低。貯藏60d時出現(xiàn)第2個高峰，則可能是因為貯藏后期青皮核桃衰老的原因所致。在貯藏75d時，CK的MDA含量略高于SY1和SY2，SY3的MDA含量極顯著(P＜0.01)低于其他各組?？梢?，處理組能夠降低MDA含量，其中，SY3延緩青皮核桃衰老的效果最好。

2.4 納他霉素對青皮核桃多酚氧化酶(PPO)活性的影響

PPO含量增加能夠氧化酚類物質(zhì)造成酶促褐變，從而降低酚類物質(zhì)的抗氧化能力［12］。

圖4 納他霉素對青皮核桃PPO比活力的影響Fig.4 Effect of natamycin on PPO activity of green juglans

由圖4可見，CK的PPO比活力出現(xiàn)先降后升的趨勢，處理組則呈波浪式變化。貯藏初期各組青皮核桃的PPO比活力均下降，可能是低溫環(huán)境降低果實的代謝速率，抑制褐變發(fā)生。在貯藏30d，各處理組均出現(xiàn)了峰值，CK的PPO活性略高于處理組，而CK則未出現(xiàn)PPO活性高峰，可能是由于納他霉素加強了核桃仁應(yīng)對環(huán)境的能力，因而之后的PPO比活力略有下降。在貯藏75d時，CK的PPO比活力迅速增大，各處理組也再次均出現(xiàn)峰值，可能是青皮核桃的品質(zhì)急劇下降，衰老加速所致，此時CK的PPO比活力為12.067 0.01ΔA/［g(FW)·min］，極顯著(P＜0.01)高于 SY1(11.05 0.01ΔA/［g(FW)·min］、SY2(10.46 0.01ΔA/［g(FW)· min］、SY3(10.22 0.01ΔA/［g(FW)·min］。在整個貯藏期中，CK 的PPO比活力均高于處理組，SY3的PPO比活力均低于SY1、SY2?？梢?，SY3處理能夠有效地降低核桃PPO比活力，延緩其衰老。

2.5 納他霉素對青皮核桃過氧化氫酶(CAT)活性的影響

CAT能減少果實內(nèi)的H2O2積累，從而延緩果實衰老。圖5結(jié)果顯示，各組的CAT活性均呈先增后降的趨勢，CK呈單峰曲線，在貯藏45d出現(xiàn)CAT活性高峰(7410.98{0.01ΔA/［g(FW)·min］};而處理組呈雙峰趨勢，在貯藏15d和45d均有高峰，由此看出，納他霉素處理誘導(dǎo)了CAT活性高峰的出現(xiàn)。在貯藏15d，CK的CAT酶活性僅為4 963.79{0.01ΔA/［g(FW)·min］}，極顯著(P＜0.01)低于各處理組的 CAT 活 性 (6323.53、7187.23、7829.36{0.01ΔA/［g(FW)·min］}。在貯藏45 d 時，SY3 的CAT 酶活性(9 215.61{0.01ΔA/［g(FW)·min］}顯著(P＜0.05)高于其它組，但其他組之間并無明顯差異。在整個貯藏期，CK的CAT比活力低于處理組，SY3的CAT的酶活性均高于SY1、SY2。結(jié)果表明，納他霉素處理組能有效地提高CAT比活力，其中以SY3的效果最佳。

圖5 納他霉素對青皮核桃CAT比活力的影響Fig.5 Effect of natamycin on CAT activity of green juglans

2.6 納他霉素對青皮核桃脂氧合酶(LOX)活性的影響

LOX以細胞膜釋放的游離脂肪酸為底物，催化形成氫過氧化物、自由基和茉莉酸(JA)等促進衰老的物質(zhì)，故其直接或間接地參與組織的衰老進程［13］。

圖6 納他霉素對青皮核桃LOX比活力的影響Fig.6 Effect of natamycin on LOX activity of green juglans

如圖6所示，各組的LOX的比活力的變化趨勢均為先增后降再增的雙峰曲線。在貯藏15d時出現(xiàn)第一個峰值，此時 CK的峰值(54.51{0.01ΔA/［g(FW)·min］}略高于各處理組的峰值。在貯藏60d時，各組均出現(xiàn)第二個高峰，此時CK的LOX比活力(64.48{0.01ΔA/［g(FW)· min］}均高于 SY1(54.48{0.01ΔA/［g(FW)· min］}、SY2(54.53{0.01ΔA/［g(FW)·min］}、SY3(44.53{0.01ΔA/［g(FW)·min］}。這可能是由于青皮核桃的品質(zhì)急劇下降，衰老加速所致。在整個貯藏期中，CK的LOX活力高于各處理組的LOX活力，而SY3的LOX比活力低于SY1與SY2。說明SY3處理能有效降低LOX活性，延緩衰老。

3 討論

3.1 納他霉素對青皮核桃品質(zhì)的影響

納他霉素是目前國內(nèi)外唯一的抗真菌防腐劑，是一種天然、廣譜、高效安全的酵母菌及霉菌等絲狀真菌抑制劑，它不僅能夠抑制真菌，還能防止真菌毒素的產(chǎn)生。有關(guān)納他霉素在青皮核桃的應(yīng)用目前尚未見報道。Zhou［14］研究發(fā)現(xiàn)，對紅地球葡萄進行納他霉素處理，可有效地降低呼吸強度、失重率、腐爛率和落粒率。周翠英［15］研究發(fā)現(xiàn)，納他霉素處理可有效控制草莓果實表面霉菌數(shù)量，減慢葉柄葉綠素含量下降的速率，抑制果實有機酸與糖分的下降，較好地維持果實的營養(yǎng)，延長貯藏期。本文實驗表明，納他霉素可以降低青皮核桃的霉腐率與a*值的升高，能夠延緩MDA含量的增加，其中以1 000 mg/L納他霉素處理效果最好。

3.2 納他霉素處理對青皮核桃PPO、CAT和LOX活性的調(diào)控

CAT屬于抗氧化酶，能及時清除活性氧，保持膜結(jié)構(gòu)完整，與果實的成熟及衰老有關(guān)。有研究表明，當植物受到病原菌侵害時，CAT的活性升高，抗氧化性加強、木質(zhì)素合成、次生代謝加快，以抵抗病原菌的侵染［16］，CAT在木質(zhì)素生物合成的最后一步反應(yīng)過程中催化H2O2分解而發(fā)揮作用［17］，有效延緩了果實衰老。本實驗納他霉素處理促進了CAT活性，從而提升了青皮核桃對病原菌的抵抗能力。

PPO是存在于植物體內(nèi)與抵抗病原微生物浸染有關(guān)的酶［18］。PPO在酶促褐變中起重要作用，PPO含量增加能夠氧化酚類物質(zhì)造成酶促褐變，降低酚類物質(zhì)的抗氧化能力。本實驗中的納他霉素處理抑制了青皮核桃的PPO活性，從而延緩其衰老。

LOX與果實的成熟衰老密切相關(guān)，LOX啟動膜脂過氧化作用，使膜磷脂不斷水解，產(chǎn)生游離脂肪酸。研究表明，LOX在植物的生長、發(fā)育、成熟衰老以及機械傷害、病蟲侵染等過程起調(diào)節(jié)作用［19］。本實驗納他霉素處理抑制了核桃LOX活性，這可能是納他霉素的抗菌性抑制了核桃LOX的活性。

本實驗結(jié)果表明，納他霉素處理能夠有效控制青皮核桃霉腐率的增加，較好的保持青皮核桃的原有色澤，延緩MDA含量的增加，提高CAT活性，降低PPO和LOX活性。其中，以1 000 mg/L納他霉素處理的青皮核桃的保鮮效果最佳。

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