薛俊宇 李 華

(1. 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院病原生物學(xué)系暨廣東普通高校新發(fā)傳染病防治重點實驗室, 廣州 510515; 2. 南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510515)

核酸檢測在寄生蟲檢測中已發(fā)揮了重要作用，主要方法有核酸雜交、PCR、實時PCR等，但這些方法要求較高的實驗條件，并且費(fèi)用高。自從Notomi等(2000)建立環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)以來，在疾病診斷中越來越受到青睞。LAMP具有操作簡便、所需時間短、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點，目前已經(jīng)用于各種病原體的檢測及腫瘤、胚胎性別的鑒別等領(lǐng)域(Fuetal., 2011)。LAMP在檢測過程中受到多種因素的影響，在寄生蟲病診斷方面尚處于起步階段。本文根據(jù)近年的研究進(jìn)展，對寄生蟲LAMP檢測的影響因素及應(yīng)用進(jìn)行綜述，為寄生蟲病診斷研究提供參考。

1 LAMP檢測寄生蟲感染的影響因素

作為一種改良的核酸擴(kuò)增技術(shù)，LAMP相對于傳統(tǒng)PCR具有諸多優(yōu)勢。該技術(shù)利用目的基因的6個靶位設(shè)計4～6個引物，在60～65℃等溫條件下，通過鏈置換反應(yīng)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，能將原有的基因拷貝數(shù)擴(kuò)增至109倍。但是在檢驗過程中，LAMP的檢測效能受多種因素影響。

1.1 靶標(biāo)基因的篩選

LAMP作為一種快捷有效的核酸檢測方法，其檢驗?zāi)芰εc靶標(biāo)基因的選擇密切相關(guān)?；?個靶標(biāo)位點，LAMP能檢測到幾個拷貝數(shù)以上的DNA片段。在檢測寄生蟲感染時，可選取核糖體小亞基DNA(SSU rDNA)、特異性抗原基因及分子遺傳標(biāo)記等。

1.1.1核糖體小亞基DNA：核糖體小亞基DNA是目前公認(rèn)具有廣泛的物種多態(tài)性的基因，大量研究表明，核糖體小亞基DNA在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)較多，且存在大量種屬特異性的基因位點，已廣泛應(yīng)用于各類寄生蟲的核酸檢測中。van Eys等(1992)發(fā)現(xiàn)利什曼原蟲SSU rDNA中央?yún)^(qū)片段動基體基因易發(fā)生突變，是檢測動基體目原生動物的良好靶點。Fontanilla等(2008)發(fā)現(xiàn)管圓線蟲屬SSU rDNA 5′端480 bp內(nèi)存在管圓線蟲3期幼蟲特異性基因位點。Chen等(2011)根據(jù)18S rDNA基因設(shè)計引物，對福壽螺肺組織內(nèi)廣州管圓線蟲做LAMP檢測，其特異性和敏感性均達(dá)到100%，檢驗極限達(dá)1 fg/μL。Han等(2007)根據(jù)四種瘧原蟲18S rDNA成功實現(xiàn)了LAMP的血清中瘧原蟲檢測。鑒于上述成功的案例，SSU rDNA可作為寄生蟲LAMP檢測的候選靶標(biāo)基因。

1.1.2特異性抗原基因： 隨著ELISA等免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用，大量的特異性抗原被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于病原體的臨床診斷中，而這些特異性抗原基因也逐漸應(yīng)用于核酸檢測中。Lau等(2011)根據(jù)諾氏瘧原蟲頂端膜抗原-1(apical Membrane antigen-1,AMA-1)設(shè)計引物，對74例血液樣本做AMA-1 LAMP檢測，與 SSU rDNA特異性巢式PCR對比，其敏感性及特異性均為100%。 Wang 等(2012)根據(jù)布氏錐蟲屬M(fèi)APK5(TbMAPK5)設(shè)計引物，對涎傳錐蟲亞屬TbMAPK5 LAMP 的檢驗極限達(dá)到 1 000 蟲體/mL。Iseki等(2007)利用牛巴貝蟲的棒狀體相關(guān)蛋白-1(rhoptry associated protein-1,RAP-1),通過在同一反應(yīng)體系設(shè)計兩套不同基因的引物，對牛血清中牛巴貝蟲B.bovis和雙芽巴貝蟲B.bigemina進(jìn)行多重LAMP檢測，檢驗極限是傳統(tǒng)PCR的105倍和巢式PCR的103倍。因此，特異性抗原基因可作為寄生蟲潛在靶標(biāo)基因。

1.1.3分子遺傳標(biāo)志： 在寄生蟲病流行地區(qū)通常多種寄生蟲并存。免疫診斷時常出現(xiàn)交叉陽性反應(yīng)難以鑒別，因此，種屬特異性核酸檢測顯得尤為重要。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)的長度和序列變化較大，可用于生物的種屬鑒定。ITS-1區(qū)域受外界環(huán)境因素的影響較小，進(jìn)化速度較快，是系統(tǒng)發(fā)育分析的重要分子標(biāo)記(Chuetal., 2001)，同時也是檢測寄生蟲基因多態(tài)性的一個重要基因(崔立云與張霄霄等, 2012)。Liu等(2013)利用ITS-LAMP成功區(qū)分瑟氏泰勒蟲Theileriasergenti和中華泰勒蟲Theileriasinensis。Liu等(2012)根據(jù)廣州管圓線蟲ITS-2基因?qū)衷片旇輧?nèi)廣州管圓線蟲做LAMP檢測，結(jié)果顯示其檢驗極限可達(dá)0.1 fg/μL。另外，線粒體DNA(mtDNA)與核DNA 的復(fù)制相對獨(dú)立且無內(nèi)含子， 其基因組的某些區(qū)域的序列進(jìn)化速率相對較快，如細(xì)胞色素C 氧化酶3個亞基的編碼基因(COⅠ、COⅡ和COⅢ)也是理想的分子遺傳標(biāo)志，在寄生蟲地理株檢測方面具有高度特異性(崔立云與張霄霄等, 2012)。

選擇靶基因時，LAMP對靶基因片段的長度亦有限制。由于鏈置換反應(yīng)對于LAMP的限制，其靶標(biāo)基因的長度應(yīng)選擇在300 bp左右，若超過500 bp,則會導(dǎo)致擴(kuò)增量的減小，不適合作為LAMP靶標(biāo)基因(Lauetal., 2011)。

1.2 引物設(shè)計

引物在核酸檢測中起關(guān)鍵性作用，引物設(shè)計的基本原則在此不作贅述。LAMP需根據(jù)靶標(biāo)基因的6個靶點(F1-3，B1-3)設(shè)計2對引物。目前多采用PrimerExplorer (Eiken, Japan http://primerexplorer.jp/e/)或者LAMP Designer(PREMIER Biosoft, USA)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(Notomietal., 2000; Tomlinson, 2013)。環(huán)狀引物(loop Primer)根據(jù)LAMP產(chǎn)生的莖環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計，可以與莖環(huán)結(jié)構(gòu)雜交而激活新一輪的擴(kuò)增，一般為左右兩條。若沒有足夠的環(huán)狀引物的位點，可設(shè)計單條引物或者不添加環(huán)狀引物。使用環(huán)狀引物可明顯縮短LAMP的反應(yīng)時間，提高LAMP的檢驗極限(Nagamineetal., 2002)。Njiru(2008) 等利用LAMP檢測布氏錐蟲小鼠血清抗體相關(guān)基因(SRA gene)時，發(fā)現(xiàn)加入環(huán)狀引物后LAMP最佳反應(yīng)時間由原來的50 min縮短至20～25 min，且檢驗極限由原來的 1 000 蟲體/mL降至1蟲體/mL。

1.3 樣本采集與處理

1.3.1樣本的采集：目前LAMP檢測可選的樣本有腦脊液、血清、熱處理的全血、組織、排泄物等。檢測時，需根據(jù)寄生蟲特點和寄生部位進(jìn)行采樣。對于不同蟲株，由于診斷意義不同，取樣部位也不同。如檢測布氏錐蟲宜采用血液樣本，而檢驗二期人類非洲錐蟲病(Human African Trypanosomiasis,HAT)則選用腦脊液標(biāo)本(Njiruetal., 2011; Wangetal., 2012)。LAMP檢測的樣本來源詳情見表1。Flinders Technology Associated研制的FTA ?試紙能夠在室溫下長期保存，簡化操作步驟，減少DNA提取過程中交叉感染的可能性，適用于現(xiàn)場樣本的采集(Yamamuraetal., 2009)。

1.3.2樣本的預(yù)處理：由于Bst DNA多聚酶對于血漿中的多聚酶敏感度較低，因此，理論上LAMP檢測的樣本可不經(jīng)處理，但利用表面活性劑預(yù)處理瘧原蟲標(biāo)本可以提高LAMP的診斷效能(Grabetal., 2011)。常用的表面活性劑有Triton X-100和Tween-20等非離子型表面活性劑。某些原蟲(如隱孢子蟲等)由于其卵囊與人類細(xì)胞膜融合，表面出現(xiàn)脂筏結(jié)構(gòu)，對氯和非離子表面活化劑耐受性增加(Sekikawaetal., 2011)，因此，主要采用凍融法。在樣本處理時若使用SDS，所獲得的DNA還需純化。Sekikawa(2011)發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲LAMP檢測中用十二烷基肌氨酸鈉(n-lauroylsarcosine sodium salt,LSS)代替SDS可以省略DNA純化的步驟，但要注意使用濃度。0.01% LSS對Bst DNA無抑制作用，但大于0.1%的LSS對Bst DNA有抑制作用。作者在隱孢子蟲樣本中先用0.1%LSS處理，有效的從卵囊中提取DNA之后再加入5% Triton X-100 或Tween-20處理，使LSS濃度降至0.01%，從而減少LSS對Bst DNA的抑制作用。

表1 各類寄生蟲LAMP檢驗情況Tab.1 Summary of LAMP detection of parasite in previous study

續(xù)表1Tab.1continued

分類Category種屬Species檢測基因/GeneBank序列號Gene/GeneBank Accessary No.樣本來源 Specimen環(huán)Loop反應(yīng)溫度Reacting temperature檢驗極限D(zhuǎn)etecting limit參考文獻(xiàn)ReferenceT.annulataAnkara hypothetical protein(TA04795)Blood+6310 pg/μLSalih et al., 2008T. evansiVSG gene (AJ870486)Blood+630.1 parasites/mLNjiru et al., 2010T. sergentip33(D87198)Blood-630.000002% para-sitemiaWang et al., 2010T. sergenti NingxianITS(EF547930)Blood-6110 fg/μLLiu et al., 2013T. sinensis WeiyuanITS(EF547932)Blood-6310 fg/μLTheileria parvap150 L47230Blood+63100 fgThekisoe et al., 2010PIM L41833Blood+60100 fg吸蟲O.viverriniITS-1 (EU038151)Feces+651 pg/μLArimatsu et al., 2012TrematodeP.westermaniITS-2(AF159604)Multi-2+600.01 fg/μLChen et al., 2011S.japonicum28S ribosomal DNA (Z46504)Tissue-65100 fg/μLKumagai et al., 2010SjR2 (AF412221)Blood-650.08 fg/μLXu et al., 2010S.haematobiumDraI(DQ157698.1)Tissue-630.1 fg/μLAbbasi et al., 2010S.mansoniSm1-7(M61098.1)Tissue-630.1 fg/μL線蟲A.cantonensis18S rRNA (AY295804.1)Tissue-651 fg/μLChen et al., 2011NematodeITS1(GU587760.1)Tissue-650.1fg/μLLiu et al., 2011W.bancroftiscaffold/matrix attachment region(AY297458)Blood-620.1 pg/μLTakagi et al., 2011B.malayiHha I(M12691)Blood+630.01 ngPoole et al., 2012絳蟲T.saginataTsag-cox1 (AB441816)Feces-635 EPGNkouawa et al., 2010TeaniaT.asiaticaTasi-cox1 (AB441817)Feces-635 EPGT.soliumTsol-cox1 (AB441815)Feces-631 copies/tubeEchinococcus granulosus12S rRNA(AF297617)Eggs-631 egg/200 μL徐祥珍等, 2011巴貝斯蟲B.gibsoni18S rDNA (AF205636)Blood-630.0005% para-sitemia1Ikadai et al., 2004BabesiaB.bovisRAP-1 (AF027149)Blood-640.0001% para-sitemia1Iseki et al., 2007B.bigeminaRAP-1 (M60878)Blood-640.00001% para-sitemia1B.canisputative rhoptry protein gene (M91168)Blood-6425 pg/μLMuller et al., 2010隱孢子蟲C.hominisSAM geneFeces+63-Bakheit et al., 2008Cryptosporidi-umC.meleagridisC.parvumgp60(AB237136)Feces+63-C.andersoniHSP-70(DQ989577)Feces+63-C.bovis18SrRNA(3873244)Feces-65-阿米巴E.histolyticaSSU rDNA (X64142)Feces-631 parasites/tubeLiang et al., 2009AmoetaAcanthamoeba spp.18S rRNAParasite-6510 pg/μLLek-Uthai et al., 2009

1 1% 寄生蟲血=5×107受感染紅細(xì)胞/200 μL。1% parasitemia=5×107infected RBC/200 μL.

2 此反應(yīng)中樣本包括血液樣本和痰液樣本。The samples contains Blood and sputum samples.

1.3.3DNA提?。撼Ｓ玫腄NA提取方法有加熱法、濾紙法等，也有商業(yè)化DNA提取試劑盒。由于血液樣本中含有大量球蛋白，抑制Taq DNA多聚酶活性，因此，PCR在提取DNA后必須進(jìn)行純化。而Bst DNA多聚酶對血漿中的多聚酶抑制物質(zhì)敏感度較低，因此，理論上LAMP不需要DNA純化。Lucchi(2010)等在對比煮沸法與商業(yè)試劑盒提取DNA的效果時發(fā)現(xiàn)，使用煮沸法時LAMP檢驗極限為4個蟲體/mL，而試劑盒則能達(dá)到0.4個蟲體/mL。這可能與試劑提取DNA的操作流程標(biāo)準(zhǔn)化以及DNA的純度較高有關(guān)。因此，建立LAMP方法時應(yīng)根據(jù)診斷效能選用合適的DNA提取方法，并建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程。

1.4 LAMP反應(yīng)

1.4.1反應(yīng)體系：目前LAMP法反應(yīng)體系為25 μL，體系包含F(xiàn)IP和BIP，F(xiàn)3和B3，dNTPs， Tris-HCl(pH 8.8),KCI,MgSO4,(NH4)S04,Tween-20,Betaine和Bst DNA聚合酶(8 U/μL)。當(dāng)建立一個新的反應(yīng)體系時需要優(yōu)化MgSO4和Betaine的濃度(Tomlinson, 2013)。

1.4.2DNA多聚酶： 目前大多數(shù)LAMP使用的是Bst多聚酶。近年市場上出現(xiàn)了一些新型的多聚酶，如New England公司的Bst多聚酶的大片段Bst2.0和OptiGene 的Isothermal Master Mix，能縮短LAMP的反應(yīng)時間(Pooleetal., 2012)。提高DNA多聚酶的效能將成為今后LAMP技術(shù)提升的重要因素(Morietal., 2013)。

1.4.3反應(yīng)溫度：LAMP擴(kuò)增主要是依靠BstDNA多聚酶進(jìn)行DNA的復(fù)制，溫度可影響B(tài)stDNA的活性。大多數(shù)LAMP反應(yīng)的最適宜溫度為60～65℃，部分反應(yīng)在62～66℃。(Tomlinson, 2013) 在反應(yīng)結(jié)束時應(yīng)當(dāng)以80～90℃加熱2～5 min以終止擴(kuò)增反應(yīng)。當(dāng)建立一種新的LAMP檢測體系時，可設(shè)立一定的溫度梯度，通過比較其反應(yīng)時間及檢驗極限得出其最佳溫度。各種寄生蟲LAMP檢測的最適宜溫度見表1。

1.4.4反應(yīng)時間： 大多數(shù)LAMP的反應(yīng)時間為60 min，也有超過90 min的報道。但超過90 min后不僅無法提高LAMP的敏感性，同時可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，干擾實驗結(jié)果。當(dāng)建立一種新的LAMP檢測體系時，可在25 μL體系最適溫度下設(shè)立一定的時間梯度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)DNA條帶亮度選擇最亮條帶對應(yīng)的反應(yīng)時間作為最佳反應(yīng)時間。

1.5 LAMP產(chǎn)物的檢測

LAMP在擴(kuò)增的同時產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，使反應(yīng)體系變渾濁，通過濁度的對比，可直觀的了解LAMP的擴(kuò)增情況。目前常用的LAMP產(chǎn)物檢測方法包括凝膠電泳、熒光檢測法、實時濁度法等。

1.5.1凝膠電泳法： 凝膠電泳是最常用的產(chǎn)物檢測方法之一。亦可先用限制性內(nèi)切酶將擴(kuò)增產(chǎn)物剪切，電泳可檢測到特異性核酸條帶。該法穩(wěn)定可靠，但費(fèi)時。

1.5.2UV法： 在反應(yīng)前加入能使dsDNA染色的熒光劑?？蛇x用SYRB GREEN I、SYTO-9和FD等對BstDNA多聚酶抑制程度較輕的熒光顯色劑。自然光下呈綠色，紫外光下發(fā)出綠色熒光。該方法簡便快捷，可直觀的反映LAMP擴(kuò)增情況。但UV法只能定性判斷LAMP是否擴(kuò)增，適用于現(xiàn)場檢測。值得注意的是往反應(yīng)管中添加染料時容易造成污染而引起假陽性。

1.5.3實時濁度法(real-time turbidimeter method)：實時濁度法可以實時檢測反應(yīng)過程中所產(chǎn)生的白色沉淀，從而實現(xiàn)對LAMP反應(yīng)全程的實時監(jiān)控。同時，實時濁度法簡化了實驗步驟，減少了反應(yīng)體系污染，降低了假陽性的幾率，但價格較為昂貴。

2 LAMP在寄生蟲病檢測中的應(yīng)用價值

LAMP作為新一代的核酸檢測技術(shù)，具有高度特異性與敏感性，在呼吸道病毒、HIV、大腸桿菌、結(jié)核桿菌等檢測中取得了較好的效果(Sankaretal., 2011)。對痰檢陽性標(biāo)本具有較高的敏感性，達(dá)到97.7% (173/177)(Neonakisetal., 2011)。

在寄生蟲檢測方面，LAMP已應(yīng)用于部分寄生蟲的實驗室檢測及流行病學(xué)調(diào)查，如瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、巴貝斯蟲、泰勒蟲、弓形蟲、絳蟲、隱孢子蟲等。目前，瘧原蟲、利什曼原蟲、人類非洲錐蟲等已經(jīng)進(jìn)入臨床檢驗研究階段(2012)。Eiken公司已經(jīng)推出瘧疾的LoopAmpTM試劑盒并利用其進(jìn)行了場地檢測。Heidi Hopkins等(2013)利用LAMP試劑盒檢測烏干達(dá)272名門診病人血清樣本，結(jié)果顯示在P.falciparumqPCR 效價≥2 蟲體/μL的樣本中，LAMP的敏感性為97.8% (95%CI 93.7%～99.5%)。在利什曼原蟲檢測方面，Verma等(2013)利用杜氏利什曼原蟲動基體DNA(Kinetoplast Minicircle DNA)對新德里采集的55份惡性利什曼原蟲(VL)靜脈血樣本、15份惡性利什曼原蟲(VL)骨髓樣本和62份黑熱病皮膚利什曼病(PKDL)的組織學(xué)樣本做LAMP檢測，其敏感性均大于96%，特異性為98.5%。LAMP用于寄生蟲檢測的詳情見表2。

表2 LAMP在寄生蟲檢測中的應(yīng)用情況Tab.2 Summary of LAMP sensitivity and specificity in the detection of parasite in some previous studies

1.YD指數(shù)=(敏感性+特異性)-1 YD Index=(sensitivity+Specificity)-1。

3 問題與展望

LAMP方便快捷，操作簡易，具有高度的敏感性和特異性，在臨床診斷和現(xiàn)場檢測有一定優(yōu)勢。由于敏感性過高，LAMP在現(xiàn)場檢測過程中，很有可能出現(xiàn)假陽性。因此，建立LAMP檢測體系時，應(yīng)充分考慮各方面的影響因素(表3)，優(yōu)化反應(yīng)條件，以減低非特異性擴(kuò)增，提高檢測的特異性。

表3 LAMP反應(yīng)因素Tab.3 Summary of the influence factor in LAMP reaction

LAMP從Kuboki等(2003)首次檢測人類非洲錐蟲病病原體以來，在病原檢測方面得到了迅速發(fā)展。簡化反應(yīng)流程，減少反應(yīng)體系，樣本傳送及μTAS技術(shù)的應(yīng)用已成為未來LAMP的發(fā)展趨勢，通過減少假陽性的發(fā)生率，降低成本，進(jìn)一步為LAMP成為臨床快速檢測創(chuàng)造條件(Morietal., 2013)。LAMP與微流體芯片技術(shù)的結(jié)合使得病原體重點照護(hù)檢驗(Point-of-care test,POCT)成為可能(Morietal., 2009)，并已經(jīng)嘗試對大腸桿菌(Safaviehetal., 2012)，沙門氏菌(Hsiehetal., 2012)等細(xì)菌(Fangetal., 2012)及HIV等病毒(Sunetal., 2013)進(jìn)行快速檢測。

盡管LAMP在多數(shù)寄生蟲的檢測中尚處于研究階段，隨著研究的不斷深入和現(xiàn)場試用的范圍擴(kuò)大，LAMP作為新一代核酸檢測技術(shù)將在寄生蟲病的診斷和現(xiàn)場檢測中發(fā)揮重要作用。