任莉莉 問明 李淑青 宋子正 商琰紅 王素云 魏影非

白血病是一類起源于骨髓多能干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其發(fā)生和發(fā)展的主要原因是白血病細(xì)胞不能有效的激活T細(xì)胞而逃脫宿主免疫系統(tǒng)監(jiān)視和清除。樹突狀細(xì)胞(DCs)是能激活初始型T細(xì)胞(native T cells)的專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)［1］，在激發(fā)抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)引起的過繼性免疫治療腫瘤中具有重要地位，成為腫瘤免疫治療研究的熱點(diǎn)。但體內(nèi)DCs的含量很少，難以滿足臨床應(yīng)用的需要。研究表明，DCs可在體外誘導(dǎo)、擴(kuò)增，并可體外有效激活、誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫。但DCs體外培養(yǎng)需要大量細(xì)胞因子，有研究也通過體外試驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細(xì)胞介素-4(IL-4)，僅可使部分慢性髓性白血病(CML)原代細(xì)胞分化為DCs，且表面免疫分子表達(dá)低于正常細(xì)胞來源的 DCs，特別是 CD80、HLA-DR［2］。并且從急性髓細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)DCs比CML細(xì)胞困難，以往的試驗(yàn)相對(duì)集中在CML來源，AML來源研究的較少，因此，有必要進(jìn)一步探索提高體外誘導(dǎo)AML來源DCs質(zhì)量的方法。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 重組人GM-CSF由華北制藥金坦公司惠贈(zèng);重組人IL-4為美國Pepprotech公司產(chǎn)品，比活性13 U/ng;異硫氰酸熒光素(FITC)-CD1a單抗、FITC-CD80單抗、藻紅朊熒光素(PE)-CD83單抗、PE-HLA-DR單抗為美國B-D公司產(chǎn)品;IFN-γ試劑盒為深圳晶美生物工程公司。噻唑蘭(MTT)購于Ameresco公司。藥品:參附注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司提供;批號(hào):050802。人急性髓性白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞株由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)天津血液病研究所惠贈(zèng)。

1．2 儀器 潔凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)，恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國SHELDON公司)，低速離心機(jī)(日本KUBOTA)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，流式細(xì)胞儀(Vantage美國B-D公司)，酶標(biāo)儀(北京Bintag公司)。

1．3 方法 DCs的培養(yǎng)和測定參照 Choudhury等［1，2］的方法，并加以改良。

1．3．1 體外誘導(dǎo)HL-60DCs:取HL-60細(xì)胞(調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105/ml)，選用 IL-4+GM-CSF(終濃度分別為 50 ng/ml、100 ng/ml)、不 同 濃 度 的 SFI(9．38 mg/ml、18．75 mg/ml、37．5 mg/ml、75 mg/ml、150 mg/ml，均為生藥濃度)及 IL-4+GM-CSF聯(lián)合不同濃度的SFI(濃度分別同上)三種不同組合于37℃，5%CO2條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細(xì)胞，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長的動(dòng)態(tài)變化。

1．3．2 DCs的流式細(xì)胞術(shù)分析:收集培養(yǎng)8～12 d的細(xì)胞，800 r/min離心10 min，取上清－20℃凍存留測細(xì)胞因子，細(xì)胞用PBS洗2次，以PBS懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，分別加入抗FITC-CD1a、抗FITC-CD80、抗PE-CD83和抗PE-HLADR單克隆抗體，置暗處室溫下反應(yīng)15 min，上機(jī)檢測。

1．3．3 DCs刺激同種混和淋巴細(xì)胞反應(yīng)(allo-MLR):取培養(yǎng)的DCs，800 r/min離心10 min，用 PBS洗2次，加入絲裂霉素 C 25 μg/ml，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育 30 min，PBS洗3次作為刺激細(xì)胞。分離健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMNC)，以完全培養(yǎng)基37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，輕輕吸出懸浮細(xì)胞，作為同種異體淋巴細(xì)胞即效應(yīng)細(xì)胞。將刺激和效應(yīng)細(xì)胞分別用RPMI-1640完全培養(yǎng)基懸浮，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml，分別以 1×103/孔、3×104/孔和1×104/孔刺激細(xì)胞加入96孔平底培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，再加入效應(yīng)細(xì)胞1 ×105/孔。即 DC∶淋巴細(xì)胞比例為1∶100，1∶30，1∶10。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照孔，即只加入1×105/孔效應(yīng)細(xì)胞，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。補(bǔ)充培養(yǎng)基至總體積200 μl。在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后，每孔加入 MTT(5 mg/ml，每孔20 μl)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)，1 500 r/min離心5 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔中加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，振蕩混勻，560 nm檢測OD值，3孔OD值取均值命名為A。刺激指數(shù)(SI)=實(shí)驗(yàn)孔A值/空白對(duì)照孔A值。

1．3．4 IFN-γ的測定:取上述凍存的上清，采用雙抗體夾心ELISA法測定IFN-γ的含量，具體方法參照深圳晶美生物工程公司的ELISA檢測試劑盒說明書。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件，多組均數(shù)間比較采用多因素方差分析;兩兩比較采用LSD和SNK-q法檢驗(yàn);采用析因設(shè)計(jì)的方差分析檢驗(yàn)SFI與(GM-CSF+IL-4)聯(lián)合使用時(shí)的協(xié)同作用;采用直線相關(guān)分析 T細(xì)胞增殖反應(yīng)與 DCs數(shù)量的相關(guān)關(guān)系，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 形態(tài)觀察 處理前HL-60細(xì)胞呈球形，懸浮生長，表面光滑。僅加入GM-CSF及IL-4培養(yǎng)2 d后，2組部分細(xì)胞體積增大、增殖并開始表現(xiàn)多形性，培養(yǎng)8～12 d左右時(shí)可見較多具有典型樹突狀突起的細(xì)胞。而單獨(dú)應(yīng)用不同濃度SFI培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞可見:150 mg/ml、75 mg/ml SFI處理孔細(xì)胞全部破碎死亡，37．5 mg/ml細(xì)胞增殖緩慢，18．75 mg/ml、9．38 mg/ml處理孔中細(xì)胞體積增大并增殖明顯，但培養(yǎng)至8～12 d均未見具有樹突狀突起的細(xì)胞。GM-CSF+IL-4聯(lián)合不同濃度 SFI誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞呈現(xiàn)不同的變化:150 mg/ml SFI組中細(xì)胞全部破碎死亡、75 mg/ml SFI組體積稍增大，但增殖緩慢，且樹突狀突 起 的 細(xì) 胞 少 見;但 在 37．5 mg/ml、18．75 mg/ml、9．38 mg/ml SFI處理孔中細(xì)胞體積增大并增殖，培養(yǎng)8～12 d左右時(shí)典型樹突狀細(xì)胞比例明顯增加(圖1)，尤以18．75 mg/ml SFI組 DCs形態(tài)的細(xì)胞比例最高，并可見細(xì)胞集落。

2．2 細(xì)胞表型變化 培養(yǎng)前 HL-60細(xì)胞 DCs表型 CD1a、CD80、CD83、HLA-DR表達(dá)很低。而單獨(dú)以 SFI誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞上述DCs表型表達(dá)仍不高。以GM-CSF+IL-4誘導(dǎo)8～12 d后，細(xì)胞表型表達(dá)率均高于培養(yǎng)前和單獨(dú)以SFI培養(yǎng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，HL-60DCs的 CD80除外)。以GM-CSF+IL-4和不同濃度SFI誘導(dǎo)培養(yǎng)后，HL-60細(xì)胞以18．75 mg/ml SFI+GM-CSF+IL-4培養(yǎng)的DCs標(biāo)志表達(dá)最高，并顯著高于其他各組(P＜0．05)，且有很好的協(xié)同作用(P＜0．05)。GM-CSF+IL-4與其他濃度SFI聯(lián)用DCs表型表達(dá)率雖高于單用GM-CSF+IL-4培養(yǎng)組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見表 1。

2．3 DCs刺激同種異體T細(xì)胞增殖的能力 培養(yǎng)前HL-60細(xì)胞以及18．75 mg/ml SFI培養(yǎng)組僅有較弱的刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力，且隨著效靶比增加，刺激能力沒有相應(yīng)提高。在HL-60細(xì)胞中以GM-CSF+IL-4或SFI與GM-CSF+IL-4聯(lián)用培養(yǎng)的DCs，刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力顯著高于上述各組細(xì)胞。當(dāng)效靶比為1∶100，1∶30，1∶10 時(shí)，刺激指數(shù)分別為 1．606 ±0．074 vs．2．280 ±0．097 vs．2．415 ±0．090 和 2．106 ±0．174 vs．2．728 ±0．125 vs．3．196 ±0．137(r=0．949，P ＜0．01)。并且SFI與GM-CSF+IL-4聯(lián)用組顯著高于GM-CSF+IL-4組(P＜0．05)。見表 2。

2．4 INF-γ的分泌水平 HL-60細(xì)胞不同組合條件下培養(yǎng)的上清中均有不同程度INF-γ的分泌，其中18．75 mg/ml SFI組INF-γ 含量低于 GM-CSF+IL-4組(P ＜0．01)。GM-CSF+IL-4聯(lián)合SFI組中GM-CSF+IL-4聯(lián)合18．75 mg/ml SFI組培養(yǎng)的HL-60細(xì)胞上清中INF-γ含量顯著高于GM-CSF+IL-4聯(lián)合其他濃度SFI培養(yǎng)的細(xì)胞(P＜0．01)，且有很好的協(xié)同作用(P＜0．05)。其他濃度SFI組含量不同程度的高于GM-CSF+IL-4組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。見表3。

3 討論

急性白血病屬中醫(yī)急勞、虛癆、血證、癥積的范疇，本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)錯(cuò)雜是本病的主要病機(jī)特征，治宜扶正祛邪，使毒祛瘀化，則正氣得復(fù)。目前隨著化療方案的改進(jìn)，AML的完全緩解率不斷增加，然而無病生存的患者仍然有限，影響患者生存的主要原因就是微小殘留病灶導(dǎo)致的復(fù)發(fā)，即便造血干細(xì)胞移植仍存在復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

表1參附注射液對(duì)培養(yǎng)的HL-60DCs的細(xì)胞免疫表達(dá)的影響n=3，%，±s

表1參附注射液對(duì)培養(yǎng)的HL-60DCs的細(xì)胞免疫表達(dá)的影響n=3，%，±s

注:與誘導(dǎo)前組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01;與對(duì)照組比較，△P ＜0．05，☆P ＜0．01;與 SFI組比較，□P ＜0．05，○P ＜0．01;與 GM-CSF+IL-4 組比較，▲P ＜0．05，★P＜0．01;與 GM-CSF+IL-4+SFI(37．5)組比較，■P ＜0．01;與 GM-CSF+IL-4+SFI(18．75 組)比較，●P ＜0．01

CD83 CD1a HLA-DR CD80誘導(dǎo)前組組別 SFI(mg/ml)表達(dá)情況0．74 ±0．57 1．07 ±0．71 0．52 ±0．51 0．51 ±0．41對(duì)照組 0 0．87 ± 0．42 1．46 ±0．76 0．77 ±0．31 0．72 ±0．20 SFI組 18．75 1．80 ±0．84 2．08 ±0．76 1．26 ±0．95 2．94 ±2．20 GM-CSF+IL-4 組 0 8．33 ±1．76#☆○ 11．86 ±3．86＊△□ 0．77 ±0．31＊△□ 0．77 ±0．31 GM-CSF+IL-4+SFI組 37．5 11．93 ±3．19#☆○ 14．90 ±6．89#☆○★ 14．06 ±4．84#☆○▲ 11．38 ±4．79#☆○★18．75 18．75 ±6．18#☆○★■ 24．32 ±7．44#☆○★■ 26．99 ±7．42#☆○★■ 18．24 ±3．13#☆○★■9．38 9．33 ±1．05#☆○● 13．74 ±3．79#☆○● 15．03 ±3．89#☆○▲■ 10．02 ±3．67#☆○★●0

表2 參附注射液對(duì)培養(yǎng)的HL-60DCs刺激T細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響

表3 參附注射液對(duì)培養(yǎng)的HL-60DCs培養(yǎng)上清液中INF-γ含量的影響n=3，±s

表3 參附注射液對(duì)培養(yǎng)的HL-60DCs培養(yǎng)上清液中INF-γ含量的影響n=3，±s

注:與誘導(dǎo)前組和對(duì)照組比較，*P ＜0．05，#P ＜0．01;與SFI組比較，△P ＜0．01;與 GM-CSF+IL-4 比較，☆P ＜ 0．05，□P ＜ 0．01;與 GM-CSF+IL-4+SFI(37．5)組比較，○P ＜0．05;與 GM-CSF+IL-4+SFI(18．75)組比較，▲P ＜0．01

HL-60 cells/HL-60-DCs誘導(dǎo)前組組別 SFI(mg/ml) IFN-γ濃度(pg/ml)15．52 ±4．03對(duì)照組 0 15．75 ±5．07 SFI組 18．75 22．89 ±7．58 GM-CSF+IL-4 組 0 37．35 ±8．31*GM-CSF+IL-4+SFI組 37．5 56．67 ±10．38#△☆18．75 73．34 ±14．40#△□○9．38 45．65 ±9．34#△▲0

圖1 HL-60-DCs(Wright×1 000)

DCs起源于髓系，是迄今所知人體內(nèi)最強(qiáng)大的抗原遞呈細(xì)胞，能誘導(dǎo)原發(fā)和繼發(fā)的免疫應(yīng)答，激活輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生強(qiáng)大的抗腫瘤效應(yīng)，因此DCs用于免疫治療AML具有十分廣闊的前景。目前雖然用體外培養(yǎng)的方法可將白血病細(xì)胞誘導(dǎo)分化成為DCs，但只能使一部分白血病細(xì)胞分化為DCs，且多數(shù)白血病細(xì)胞來源的DCs表面分子的熒光強(qiáng)度低于正常來源的DCs，特別是CD80、HLA-DR，而二者是APC細(xì)胞與T細(xì)胞相互作用中最重要的信號(hào)分子，故它們的表達(dá)率和表達(dá)量常會(huì)影響T細(xì)胞的激活和功能［3］。因而如何提高DCs的產(chǎn)量及成熟度，激活其功能，更有效而特異的殺死白血病細(xì)胞是白血病免疫治療的研究熱點(diǎn)。

來源于《濟(jì)生方》或《濟(jì)生續(xù)方》中參附湯的 SFI及其組分——人參、附子均具有調(diào)節(jié)改善機(jī)體免疫的功能，可誘導(dǎo)造血基質(zhì)細(xì)胞表達(dá) GM-CSFmRNA，促進(jìn) TNF-α、IL-1、IL-2等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，配合化療可改善白血病患者正氣不足之狀［4－6］，提示SFI可能參與調(diào)節(jié)DCs抗原提呈功能，因此本試驗(yàn)通過檢測代表DCs成熟及功能的幾個(gè)指標(biāo)來研究SFI是否參與調(diào)節(jié)DCs的功能。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在GM-CSF/IL-4聯(lián)合適當(dāng)濃度(18．75 mg/ml、37．5 mg/ml)SFI的作用下，白血病細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為DCs，能明顯增強(qiáng)白血病-DCs表型(CD1a、CD80、CD83、HLA-DR)的表達(dá)率，另外還發(fā)現(xiàn)SFI對(duì)于白血病細(xì)胞存在雙向調(diào)節(jié)作用。SFI在低濃度18．75 mg/ml和9．38 mg/ml時(shí)可促進(jìn)HL-60DCs細(xì)胞的增殖。而在150 mg/ml和75 mg/ml濃度時(shí)，可導(dǎo)致HL-60細(xì)胞全部破碎死亡或增殖緩慢，而這種雙向調(diào)節(jié)作用究竟是何種機(jī)制在發(fā)揮作用，還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

我們前期的試驗(yàn)證實(shí)與本試驗(yàn)結(jié)果相似。雖然單獨(dú)應(yīng)用SFI不能誘導(dǎo)DCs的生成，但GM-CSF+IL-4聯(lián)合適當(dāng)濃度的SFI能更有效地誘導(dǎo)DCs的生成和成熟。不同濃度的SFI對(duì)不同來源DCs誘導(dǎo)生成作用不同:誘導(dǎo)CML患者的PBMNCs和K-562細(xì)胞，SFI的最佳誘導(dǎo)濃度為75 mg/ml，對(duì)HL-60細(xì)胞則為18．75 mg/ml，且在相應(yīng)的濃度下與GM-CSF及IL-4聯(lián)合使用時(shí)有很好的協(xié)同作用，SFI對(duì)不同來源的細(xì)胞，有不同的最適濃度，可能與不同細(xì)胞對(duì)SFI敏感性不同有關(guān)，增殖速度快的細(xì)胞對(duì)SFI更敏感。

綜上所述，SFI可以聯(lián)合GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞成為成熟的DCs，使其抗原遞呈功能明顯增強(qiáng)，分泌INF-γ，并表現(xiàn)雙向調(diào)節(jié)作用。當(dāng)然，還有很多問題需要我們進(jìn)一步探索，如，SFI畢竟為中藥的混合制劑，其中的主要藥物成分人參皂甙和烏頭堿在調(diào)節(jié)免疫中究竟起協(xié)同還是拮抗作用，還是某一種成分的單獨(dú)作用;烏頭堿的心臟、神經(jīng)毒性眾所周知，怎樣通過合理的比例使之更適合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用并避免不良反應(yīng);SFI在體內(nèi)有無誘導(dǎo)DCs生成及促進(jìn)DCs增殖和遞呈抗原的功能等。相信隨著研究的深入，必將會(huì)揭示SFI抗腫瘤機(jī)制的實(shí)質(zhì)，為SFI配合治療白血病提供可靠的依據(jù)。

1 劉開揚(yáng)，張洪泉．中西醫(yī)結(jié)合抗腫瘤的免疫學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19:2049-2050．

2 王俊祥，王金鎧，鄭師陵，等．人慢性髓性白血病細(xì)胞系來源的樹突狀細(xì)胞免疫功能的體外研究．南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2003，26:579-590．

3 Fan P，Wu ZH，Wang S．An Investigation on the phenotype of cultured dendritic cells from the peripheral blood of patients with breast cancer．Journal Of Nanjing Medical University Ann Hematol，2002，16:115-120．

4 Oehler L，Berer A，Kollar M，et al．Culture requierments for induction of dendritic cell differentiation in acute myeloid leukemia．Ann Hematol，2000，79:355-362．

5 陳玉春．人參、附子與參附湯的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)理研究．中成藥，1994，16:30-31．

6 王勇，王莎莉，王亞平，等．人參皂甙對(duì)人骨髓造血因子活性及其mRNA 表達(dá)的影響．解剖學(xué)報(bào)，1999，30:362-366．