王素格 李德征 蔣樹(shù)林 秦明月

近年來(lái)人們生活水平日益提高，而日常膳食中以脂肪為代表的高熱量食物成分所占比例明顯增加，使非酒精性脂肪肝炎(non alcoholic steatohepatitis，NASH)的發(fā)病率日益增長(zhǎng)［1］，從而成為人們普遍關(guān)注的問(wèn)題。有大量研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗(IR)是NASH發(fā)病的首要環(huán)節(jié)［2－4］，而過(guò)氧化物酶體增殖物激活 受 體 α(peroxisomeproliferator-activated receptoralpha，PPARα)是調(diào)節(jié)胰島素敏感性的一個(gè)重要因子，并且它的激動(dòng)劑可能減少肝臟的脂質(zhì)沉積，從而使脂肪性肝炎得到改善，因此我們通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)脂肪肝胰島素抵抗模型的成立，然后觀察IR及PPARα的mRNA在NASH中的表達(dá)情況，為NASH的治療提供新的藥物作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 建立動(dòng)物模型 雄性SD大鼠60只，體重120～160 g，鼠齡4～6周，分籠飼養(yǎng)在溫度22～28℃動(dòng)物室中，明暗各12 h，自由進(jìn)食及飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，正常組20只、高脂組20只，實(shí)驗(yàn)組10只、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組10只。正常組喂飼普通飼料;高脂組、實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組喂飼高脂飼料［5，6］，其配方:普通飼料加1%膽固醇和10%蛋黃粉、10%豬油，－20℃冰箱保存，喂前平衡室溫。12周末時(shí)正常組與高脂組各取10只一并進(jìn)行鉗夾及肝組織石蠟切片HE染色，確定胰島素抵抗脂肪肝動(dòng)物模型造模成功;實(shí)驗(yàn)組在高脂飲食同時(shí)給予非諾貝特80 mg·kg－1·d－1灌胃;實(shí)驗(yàn)對(duì)照組將高脂飲食改為正常飲食;實(shí)驗(yàn)組每天定時(shí)給藥，其余各組均給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，持續(xù)4周后所有大鼠分別測(cè)定胰島素敏感性，然后處死大鼠留取所需標(biāo)本。

1.2 主要試劑 膽固醇購(gòu)自南京新百藥業(yè)有限公司，豬油由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，非諾貝特(力平之)200 mg為法國(guó)利博福尼公司產(chǎn)品，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)采用德國(guó)Bbyer公司的全自動(dòng)血清生化分析儀檢測(cè)，由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生化室協(xié)助。RNA提取試劑盒及GAPDH均為北京賽百盛基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.3 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.3.1 一般情況:每天觀察動(dòng)物的毛色、活動(dòng)及糞便與進(jìn)食水情況，每周測(cè)定大鼠體重。

1.3.2 空腹血清TC、TG、ALT、AST及血糖測(cè)定:用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀測(cè)定，全部應(yīng)用酶法完成。

1.3.3 病理學(xué)檢查:中性甲醛固定肝標(biāo)本，石蠟包埋，常規(guī)切片行HE染色，光鏡下觀察肝臟脂肪變性及炎癥的程度。由富有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生在不知分組情況下作出診斷。對(duì)肝脂肪變性和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度分級(jí)、評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［7－9］。

1.3.4 IR的測(cè)定:用正常血糖高胰島素鉗夾技術(shù)［10］，求取60～120 min的13個(gè)GIR的平均值，該指標(biāo)反應(yīng)大鼠的胰島素敏感性，GIR越小，機(jī)體的IR越嚴(yán)重。

1.3.5 PPARα的mRNA表達(dá)水平的測(cè)定:鉗夾結(jié)束后迅速取出肝臟組織，冰上取肝臟同一部位切取1塊肝組織約100～150 mg，將組織放入高壓處理的EP管中，編號(hào)記錄后迅速液氮冷凍保存，采用RT－PCR法檢測(cè)PPARαmRNA的表達(dá)。根據(jù)參考文獻(xiàn)選取引物并合成，PPARα(Gen Bank網(wǎng)站)上游引物:5′－CCTGGAAAGTCCCTTATCT－3′，下 游 引 物:5′－GCCCTTGCAGCCTTCACAT－3′，319 bp，GAPDH 上游引物:5′－TCCCTCAAGATTGTCAGCAA－3′，下游引物:5′－AGATCCACAACGGATACATT－3′，308 bp。

①RNA提取:用Trizol一步法提取總RNA，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。②逆轉(zhuǎn)錄:用20 μl體系逆轉(zhuǎn)錄RNA ，取總RNA 2 μl，隨機(jī)引物(dN)9 1 μl，DEPC 處理水 7 μl，5 × MMLV buffer 4 μl，dNTP 2 μl Rnasin 10 U/μl，MMLV RTase 1 μl，100 m MDTT 2 μl，70℃5 min，37℃ 1 h 94℃ 5 min。③PCR 反應(yīng)體系 20 μl:取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行 PCR，10 × Taq 緩沖液2 μl，PCR 染料2 μl，Taq DNA聚合酶 0.2 μl，0.1 mmol/L，dNTP，上下游引物各20 pmol。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:預(yù)變性 94℃、5 min、1 min;變性 94、30 s，退火(PPARα 56℃;GAPDH 56℃)40 s，延伸 72℃、45 s，循環(huán)數(shù)(PPARα 35次;GAPDH 30次)，終末延伸 72℃、10 min。模板量及循環(huán)次數(shù)經(jīng)檢測(cè)均在線性范圍內(nèi)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，以UVP計(jì)算機(jī)圖像掃描分析系統(tǒng)Robocycler 4.0測(cè)定電泳條帶密度值，以GAPDH為內(nèi)參照，Excel計(jì)算PPARα基因mRNA的相對(duì)含量，結(jié)果以PPARα條帶占GAPDH條帶密度的百分率表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、方差分析和直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 4組大鼠均生長(zhǎng)良好，至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)無(wú)1例死亡。正常對(duì)照組大鼠精神充沛，靈活好動(dòng)，皮毛整潔，而高脂組性情溫順，喜臥懶動(dòng)，皮毛凌亂，光澤度差。實(shí)驗(yàn)前各組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。12周末時(shí)，高脂組及各給藥組與正常組比較，體重均明顯增加(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與高脂組比較，體重減輕(P＜0.05)，而高脂組體重比正常組顯著增高(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1大鼠體重的變化n=10，g，±s

表1大鼠體重的變化n=10，g，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與高脂組比較，#P ＜0.05

組別 0周 12周 16周167±16 365±25 408±39高脂組 170±14 440±21* 496±20實(shí)驗(yàn)組 178±9 457±39* 428±43*#實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 181±9 440±41* 460±25*#正常組

2.2 血清ALT、AST、TC及TG的變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，高脂組ALT、AST較正常組顯著增高(P＜0.01);與實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，AST明顯降低(P＜0.01)，而ALT仍高于正常范圍，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，但有下降趨勢(shì)，TC、TG明顯降低(P ＜0.01)。見(jiàn)表2。

表2大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的變化n=10，±s

表2大鼠血清生化學(xué)指標(biāo)的變化n=10，±s

注:與正常組比較，*P ＜0.05;與高脂組比較，#P ＜0.05

組別 TC(mmol/L) TG(mmol/L) ALT(U/L) AST(U/L)1.14±0.13 0.24±0.05 42±7 92±21高脂組 2.18±0.25* 0.46±0.08* 56±12* 127±30*實(shí)驗(yàn)組 1.47±0.37*# 0.23±0.05# 50±9 102±14#實(shí)驗(yàn)對(duì)照組 1.66±1.98*# 0.34±0.07*# 52±8 117±23正常組#

2.3 肝臟病理學(xué)觀察 正常組大鼠肝臟無(wú)異常變化。高脂組肝臟體積明顯增大，包膜緊張，邊緣變鈍，顏色呈土黃色，甚至可見(jiàn)局灶性黃白色變性灶，與周圍組織有粘連，切面油膩。實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組部分肝臟顏色接近正常，表面呈淺黃色，油膩減輕。

光鏡下，正常組大鼠肝臟組織HE染色未見(jiàn)明顯異常(圖1 A);高脂組肝細(xì)胞均呈彌漫性脂肪變性，肝細(xì)胞脂肪變性面積達(dá)到2/3以上，肝細(xì)胞界限不清，肝竇狹窄，部分肝組織在脂肪變的基礎(chǔ)上伴有小葉內(nèi)炎癥，大部分出現(xiàn)匯管區(qū)炎癥，小葉內(nèi)有灶性壞死，壞死灶周圍有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)肝纖維化(圖1 B);實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組脂肪變程度較高脂組明顯減輕，未見(jiàn)明顯肝細(xì)胞壞死(圖1 C、D);進(jìn)一步脂肪變及炎癥程度評(píng)分統(tǒng)計(jì)結(jié)果示:高脂組10例中脂變程度2級(jí)4例，3級(jí)6例，10例均為脂肪性肝炎;而實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組脂肪變及炎癥程度均明顯減輕，與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。

圖1 4組肝組織光鏡表現(xiàn)

2．4 血糖、葡萄糖輸注率、PPARαmRNA表達(dá)的變化 16周末，正常組空腹血糖與高脂組、實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，但高脂組有增高趨勢(shì);GIR 60～120中正常組與高脂組、實(shí)驗(yàn)組及實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。高脂組與實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。PPARα mRNA變化規(guī)律為:實(shí)驗(yàn)組、正常組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、高脂組表達(dá)量依次降低，高脂組與實(shí)驗(yàn)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠血糖、葡萄糖輸注率及暉度比值的比較

3 討論

NASH是以肝細(xì)胞脂肪變性、灶性壞死及小葉內(nèi)炎癥為特征的遺傳一環(huán)境一代謝應(yīng)激相關(guān)的臨床病理綜合征，有研究表明IR是NAFLD發(fā)病的主要環(huán)節(jié)，它使機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡紊亂，導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚，然后是氧自由基引起脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及其以瀑布效應(yīng)誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，而PPARs是一種新型甾體類激素受體，也是配體激活轉(zhuǎn)錄因子，包括PPARα、PPARβ、PPARγ3種亞型，PPARα主要表達(dá)于肝臟、腎臟、心臟和肌肉等進(jìn)行脂肪酸氧化的組織中，在脂肪肝、胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展中有著重要影響。本研究發(fā)現(xiàn)FC組大鼠肝組織中PPARα的mRNA比NC組明顯降低，IR明顯加重，肝臟脂肪變呈中重度改變;許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)PPARα激活劑是防治NASH的一種新策略，而目前已經(jīng)明確PPARα激動(dòng)劑是貝特類調(diào)脂藥，對(duì)NASH的治療作用受到廣泛關(guān)注。本研究結(jié)果顯示，與FC組相比，F(xiàn)F組與FR組PPARα的mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，從而IR改善，肝脂肪變及炎癥壞死明顯減輕，血中TG降低，以上結(jié)果表明PPARα激動(dòng)劑可改善IR，使肝臟脂肪變及炎癥程度減輕，降低血中TG水平，阻止NASH進(jìn)展，機(jī)制可能是由于PPARα被激活后一方面直接促進(jìn)肝內(nèi)脂肪酸的氧化，使合成的脂肪酸和局部脂肪酸水平降低，從而減輕了脂質(zhì)的沉積，改善胰島素抵抗;另一方面可直接改善肝臟脂蛋白和脂質(zhì)代謝的基因，使肝臟FFA的β-氧化增加，減少肝內(nèi)脂質(zhì)的沉積。值的一提的是非諾貝特組與改良組在改善脂肪變上無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，說(shuō)明在藥物干預(yù)的同時(shí)，仍然堅(jiān)持不良的生活習(xí)慣，將難以控制肝臟脂肪變性，而改變不良的飲食習(xí)慣，是防治IR的根本。但也有研究表明激活PPARα調(diào)節(jié)過(guò)氧化物酶體、微粒體中參與脂肪酸氧化的酶的表達(dá)，其持續(xù)活化在脂肪酸氧化增強(qiáng)的同時(shí)，也產(chǎn)生大量的H2O2及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，在單純性脂肪肝的基礎(chǔ)上發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化，促進(jìn)脂肪性肝炎、脂肪性纖維化的形成和發(fā)展［13－14］。

綜上所述，PPARα、IR及NASH之間關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜，深人探討它們之間的相關(guān)性將為NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供有利的證據(jù)，并為其有效的防治提供新的思路。

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