陳 翔 農(nóng)曉琳 陳 靈

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，南寧 530021

硅酮凝膠對(duì)增生性瘢痕模型中膠原表達(dá)的影響

陳 翔 農(nóng)曉琳△陳 靈

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，南寧 530021

目的研究硅酮凝膠對(duì)兔耳瘢痕模型中膠原的影響，探討硅酮凝膠的作用機(jī)制。方法構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型，在術(shù)后28 d外用硅酮凝膠噴霧劑，術(shù)后56 d處死動(dòng)物切取兔耳瘢痕，采用免疫組化的方法觀察瘢痕中Ⅰ、Ⅲ型膠原的變化情況。結(jié)果硅酮凝膠組較空白對(duì)照組瘢痕增生明顯減輕，硅酮凝膠可以抑制瘢痕中Ⅰ型膠原的形成，并對(duì)Ⅲ型膠原分泌有一定的促進(jìn)作用。結(jié)論硅酮凝膠可以顯著抑制Ⅰ型膠原的形成，調(diào)節(jié)Ⅰ、Ⅲ型膠原的比例，從而改變細(xì)胞外基質(zhì)的構(gòu)成，減輕瘢痕增生。

瘢痕； 硅酮凝膠； 膠原； 免疫組化

增生性瘢痕是病理性瘢痕中的一種主要類(lèi)型，常導(dǎo)致瘙癢、疼痛、活動(dòng)障礙等諸多并發(fā)癥，其主要病理學(xué)特征是大量成纖維細(xì)胞增生和膠原的過(guò)度沉積[1]。對(duì)于病理性瘢痕的防治一直是研究的熱點(diǎn)，目前主要以手術(shù)和非手術(shù)治療為主，但仍然缺乏足夠的認(rèn)識(shí)和特效的治療手段及藥物[2]。醫(yī)用硅酮凝膠噴霧劑(疤復(fù)新)是目前市場(chǎng)上銷(xiāo)售的防治瘢痕的外用藥物，對(duì)增生性瘢痕的治療具有一定的效果。本研究目的在于觀察硅酮凝膠對(duì)增生性瘢痕地作用，并從對(duì)膠原表達(dá)的影響方面了解其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與試劑

選取8只清潔級(jí)的健康新西蘭大耳白兔，體重2.0～2.5 kg，兔齡3～4個(gè)月，雌雄不限(不含孕兔)，兔耳發(fā)育良好無(wú)畸形(由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)。單只分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)48 h(人工混合飼料)，兔室溫度在18 ℃～22 ℃之間，相對(duì)濕度介于60％～80％。醫(yī)用硅酮凝膠噴霧劑(上海上大吉申科技開(kāi)發(fā)有限公司)，CollagenⅠ鼠抗兔單克隆一抗(英國(guó)ABCAM公司)，Collagen Ⅲ 鼠抗兔單克隆一抗(美國(guó)NOVUS公司)，通用型山羊抗鼠二抗、免疫組化試劑盒及DAB試劑盒(均為北京中杉金橋公司)，復(fù)合消化酶(武漢博士德公司)。

1.2 動(dòng)物處理及標(biāo)本制備

于兔耳腹側(cè)參照相關(guān)文獻(xiàn)[3-5]方法建立增生性瘢痕模型，每只兔耳6個(gè)創(chuàng)面，每組共96個(gè)創(chuàng)面，術(shù)后置于原環(huán)境繼續(xù)飼養(yǎng)。術(shù)后第28天可見(jiàn)兔耳創(chuàng)面基本愈合，形成早期的增生性瘢痕。按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組：空白對(duì)照組(不加任何干預(yù))和硅酮凝膠組(使用疤復(fù)新，噴涂于兔耳瘢痕，早晚各一次；藥物使用方法參照說(shuō)明書(shū)，并使藥物均勻覆蓋于瘢痕表面)。用藥期間動(dòng)物未見(jiàn)異常，無(wú)舔食藥物、咬耳等現(xiàn)象。持續(xù)用藥至術(shù)后第56天(即用藥后28 d)，處死動(dòng)物，切取兔耳瘢痕標(biāo)本及正常兔耳皮膚，將標(biāo)本置于4％多聚甲醛中固定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘇木精-伊紅染色 流水沖洗固定標(biāo)本，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，制備厚度約5 μm的石蠟切片。烤片后，脫蠟復(fù)水，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，脫水干燥后，封片，置于顯微鏡下觀察。

1.3.2 免疫組化(SP法) 將已包埋好的標(biāo)本，以5 μm的厚度連續(xù)切片。常規(guī)脫蠟、水化，PBS沖洗。復(fù)合消化酶進(jìn)行抗原修復(fù)后，PBS沖洗，過(guò)氧化氫阻斷，PBS沖洗，山羊血清孵育，傾去后滴加一抗(collagenⅠ、Ⅲ抗體濃度均為1∶500)，4 ℃過(guò)夜(陰性對(duì)照組以PBS替代一抗)。次日PBS沖洗，滴加二抗，PBS沖洗。DAB染色，顯微鏡下觀察，徹底沖洗后，蘇木精復(fù)染返藍(lán)。脫水、透明，中性樹(shù)膠常規(guī)封片，鏡下觀察，并用IPP軟件分析。

1.4 圖像分析

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

術(shù)后28 d，兩組增生性瘢痕形成明顯，較周?chē)Ｆつw突起，色紅，質(zhì)地較硬；用藥28 d后，空白對(duì)照與術(shù)后28 d相比未見(jiàn)明顯變化；硅酮凝膠組瘢痕變平，色澤及質(zhì)地與周?chē)Ｆつw相近。

2.2 鏡下觀察

蘇木精-伊紅染色可見(jiàn)，空白對(duì)照組瘢痕厚度增加，膠原及成纖維細(xì)胞增多，膠原纖維粗大致密且排列紊亂無(wú)章，并有膠原結(jié)節(jié)和旋渦狀結(jié)構(gòu)形成；硅酮凝膠組瘢痕厚度增生不明顯，膠原纖維較細(xì)且排列較為規(guī)則，成纖維細(xì)胞數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)更接近正常皮膚。兩組用藥前后差異明顯。

免疫組化顯示，空白對(duì)照組瘢痕膠原染色后顯棕黃色，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，Ⅰ、Ⅲ型膠原均有所增加，其中Ⅲ型膠原增加較為明顯，Ⅰ/Ⅲ型膠原發(fā)生變化。硅酮凝膠組瘢痕膠原染色后顯黃色，呈陽(yáng)性表達(dá)，Ⅰ型膠原明顯減少，Ⅲ型膠原有所增加，Ⅰ/Ⅲ型膠原比值發(fā)生顯著變化；較空白對(duì)照組更為接近正常皮膚的表達(dá)情況。以PBS替代一抗的陰性組膠原未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。硅酮凝膠組用藥后Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Plt;0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達(dá)(蘇木精-伊紅染色)

表1 各組Ⅰ、Ⅲ型膠原的平均光密度值

與空白對(duì)照組比較*Plt;0.05

3 討論

3.1 病理性瘢痕

皮膚病理性瘢痕是臨床多發(fā)病和常見(jiàn)病，其形成及發(fā)展與遺傳、治療等諸多方面有著密切的聯(lián)系，但主要的特征為成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生和膠原蛋白代償失調(diào)導(dǎo)致的異常堆積。作為細(xì)胞外間質(zhì)的主要成分的膠原，調(diào)控其增生、分解，將會(huì)在病理性瘢痕發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到舉足輕重的作用。

3.2 瘢痕模型

由于瘢痕的防治一直困擾著人類(lèi)，為獲得一種有效而穩(wěn)定的動(dòng)物瘢痕模型是學(xué)者努力研究的方向。動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)應(yīng)遵循可靠、相似、易行、經(jīng)濟(jì)、可重復(fù)性等原則。目前動(dòng)物瘢痕模型主要有裸鼠、新西蘭大耳白兔、豚鼠等動(dòng)物，并得到學(xué)術(shù)界的認(rèn)可。其中裸鼠和兔耳作為瘢痕模型較為理想；但由于裸鼠不能自身產(chǎn)生增生性瘢痕，而兔耳瘢痕模型制取方便易行，且在增生性瘢痕形成過(guò)程中膠原的含量及比例與人增生性瘢痕極為相似，是研究瘢痕中膠原表達(dá)變化較為理想的動(dòng)物模型[6-8]。

3.3 膠原蛋白

膠原蛋白在皮膚、肌腱、軟骨等結(jié)締組織中廣泛存在，對(duì)機(jī)體起著支持、連接等諸多作用，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。Ⅰ型膠原較為粗大在皮膚中主要起支持作用，而Ⅲ型膠原包繞著Ⅰ型膠原起到連接和物質(zhì)交換等作用。Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白作為病理性瘢痕細(xì)胞外基質(zhì)中含量最多的兩類(lèi)膠原蛋白，其過(guò)度沉積和降解減少是增生性瘢痕形成的主要原因[9]。病理性瘢痕中膠原蛋白較正常皮膚中的含量明顯不同，膠原纖維的排列也十分紊亂，并可出現(xiàn)漩渦狀結(jié)構(gòu)和膠原結(jié)節(jié)。通常表現(xiàn)為在真皮中的膠原蛋白總量明顯增加，但瘢痕組織以Ⅰ型膠原蛋白增加為主，而增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白均明顯增加，以致兩者的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白比例有明顯差異。由此可見(jiàn)對(duì)膠原總量和Ⅰ、Ⅲ型膠原比例的調(diào)控對(duì)防治瘢痕有著決定性的作用。

3.4 硅酮凝膠

硅酮凝膠噴霧劑是目前市場(chǎng)出售防治瘢痕的藥物之一，為硅酮制劑的噴霧型。臨床上主要用于多種創(chuàng)傷及外科手術(shù)后的瘢痕的預(yù)防和輔助治療，對(duì)潛在疤痕的增殖及創(chuàng)面部位的痛癢癥有良好的止痛止癢效果；其對(duì)增生性瘢痕效果較好，但作用機(jī)制仍未完全清楚[10]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型，外用硅酮凝膠噴霧劑，證實(shí)硅酮凝膠制劑對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，使細(xì)胞數(shù)量減少，胞體減小，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌的前膠原量發(fā)生改變，減輕了Ⅰ型膠原的沉積，并能改變?cè)錾择：壑孝瘛ⅱ笮湍z原的比例，從而達(dá)到防治瘢痕的目的，為進(jìn)一步利用硅酮制劑防治瘢痕提供了相關(guān)的依據(jù)。

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InfluenceofSiliconeGelonCollagenExpressioninHypertrophicScarModel

CHEN Xiang，NONG Xiaolin，CHEN Ling

DepartmentofOralamp;MaxillofacialSurgery，CollegeofStomatology，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China

ObjectiveTo study the influence of silicone gel on the collagen expression in the scar of rabbit ear hypertrophic scar model，in order to probe the mechanism of silicone gel.MethodsSilicone gel spray was used 28 days after operation to construct rabbit ear hypertrophic scar model.The rabbits were sacrificed 56 days after operation to collect scar of rabbit ears.Collagen type Ⅰand Ⅲ alteration in the scar was observed using immunohistochemical method.ResultsScar hyperplasia in the silicone gel group reduced significantly，compared to that in the control group.Silicone gel inhibited typeⅠcollagen formation significantly and have a certain role in promoting type Ⅲ collagen secretion in the scar.ConclusionSilicone gel can significantly inhibit the collagen typeⅠformation，adjust the proportion of type Ⅲ collagen，resulting in changes in extracellular matrix composition and reducing the scar hyperplasia.

scar；silicone gel；collagen；immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.01.006

△通信作者，Corresponding author，E-mail：lab.nong@gmail.com

2012-11-28)