張曉青，楊 波，姜天翔，張雨山，王 靜

(國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

海洋公益性行業(yè)科研專項項目(201105026)，國家海洋局青年海洋科學基金資助項目(2011152) 收稿日期：2013-10-12

作者簡介：張曉青(1983-)，女，福建浦城人，工程師，研究方向：海水利用技術(shù)， E-mail：radicle@163.com。

doi

：10.3969/j.issn.1672-5425.2013.12.012

一株含鹽污水降解菌的分離鑒定及其降解特性研究

張曉青，楊 波，姜天翔，張雨山，王 靜

(國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所，天津 300192)

從塘沽海灘泥樣中分離篩選出1株海洋細菌，標記為NY0935，該菌株對含鹽污水中有機物有較好的去除效果。通過形態(tài)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定該菌株為卓貝爾氏菌屬(Zobellellasp.)。將菌株NY0935投入到大生活用海水中，在溫度為25～37 ℃、pH值為6.0～10.0、NaCl濃度為0～6%的條件下，菌株可以正常生長，且對COD保持較好的去除效果。當培養(yǎng)條件為37 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為160 r·min-1時，菌株NY0935在大生活用海水中培養(yǎng)48 h后對COD去除率達到75.99%。

分離鑒定；耐鹽菌；降解特性；化學需氧量

海水直接利用包括工業(yè)生產(chǎn)用水和生活用水，海水在居民生活用水方面除了沖廁外，還可以用于洗浴、空調(diào)、景觀等[1]。隨著世界經(jīng)濟的發(fā)展和海水利用技術(shù)的日益成熟，海水利用產(chǎn)業(yè)在全世界范圍內(nèi)得到快速發(fā)展。當前，我國水資源短缺特別是水質(zhì)性短缺問題十分嚴重，為了緩解淡水資源日益緊缺的局面，國家和沿海城市相繼出臺了一系列海水利用政策，建立海水利用產(chǎn)業(yè)化基地，將海水應用于循環(huán)冷卻、生活用水、海水源熱泵等[2]。海水利用節(jié)約了淡水資源，但也導致排放的廢水中除了含有有機污染物外，還含有大量的無機鹽[3,4]。傳統(tǒng)的活性污泥法、生物膜法等污水處理工藝在處理高鹽度污水時常遇到以下問題：高鹽度不僅使微生物的酶活性喪失，而且會改變滲透壓使微生物的細胞膜破裂，降低處理效果；高鹽度還會改變污泥中微生物的組成，導致污泥流失嚴重，造成二次污染[5]。

生物強化技術(shù)是為了提高廢水處理系統(tǒng)的處理能力，向系統(tǒng)中投加從自然界篩選的優(yōu)勢菌種或通過基因組合技術(shù)產(chǎn)生的復合菌，以去除某一種或某一類有害物質(zhì)[6]。國外研究者選育耐鹽菌處理高鹽度有機廢水，并且探討了鹽度對生化系統(tǒng)處理有機廢水的影響[7-9]。Wilén等[10]研究發(fā)現(xiàn)生物強化技術(shù)可以使有機物去除率比單純普通活性污泥法提高20%，污泥產(chǎn)量減少34%，減輕了二次污染。

作者從塘沽海灘泥樣中分離、篩選出1株具有良好有機物降解能力的菌株NY0935，對其生長特性及降解能力進行初步的研究，并進行了菌株形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA序列測定，為菌株NY0935處理含鹽污水的實際應用提供了生物學理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料與培養(yǎng)基

1.1.1 泥樣

泥樣取自天津塘沽下郵局碼頭泥灘，新鮮取用。

1.1.2 大生活用海水

葡萄糖 300 mg·L-1，NH4Cl 41 mg·L-1，K2HPO49.4 mg·L-1，MgSO4·7H2O 50 mg·L-1，pH值6.5～7.5，污水中海水比例為40%，海水取自天津塘沽近海水域。

1.1.3 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基(2216E):蛋白胨5 g，酵母提取物1 g，高磷酸鐵0.1 g，陳海水1 L，pH值7.6[11]。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，pH值7.0～7.2[12]。

1.2 方法

1.2.1 菌種的富集和分離純化

將泥樣用滅菌蒸餾水溶解，空曝24 h，靜置后取上清液接入2216E液體培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r·min-1下?lián)u床培養(yǎng)3 d左右，培養(yǎng)液變渾濁后，再按1%接種量接入新鮮的2216E液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復3～5次，然后在2216E固體培養(yǎng)基平板上劃線，挑取菌落特征有明顯差異的單菌落繼續(xù)劃線分離，直至獲得單一菌株。將菌株接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24 h，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌生長和生理生化指標測定

細菌生長以波長600 nm處的濁度OD600表示。API ZYM 19種酶活檢測、API 20NE 21項指標檢測及過氧化氫酶、氧化酶、G+C含量、脂肪酸含量等指標測定參照文獻[13]進行。

1.2.3 菌株16S rDNA基因序列測定和分析

采用CTAB/NaCl法提取菌株總DNA，采用細菌16S rDNA基因通用引物(fd1：5′-AGAGTTTG ATCC-

TGGCTCAG-3′，rp2：5′-ACGGCTACCTTGTTACG-

ACTT-3′)進行16S rRNA基因片段的PCR擴增，引物由上海生工合成。

PCR反應體系為：dNTP 2 μL，Tag酶0.5 μL，引物2 μL，Loading buffer 2.5 μL，模板2 μL，水16 μL。

PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，然后進入以下循環(huán)：94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)后于72 ℃延伸 10 min。

PCR擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，PCR產(chǎn)物用UNIQ-10柱式PCR擴增產(chǎn)物純化試劑盒(上海生工)純化后連接在PMD18-T(TaKaRa)上。測序由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司完成。將所測得菌株的16S rDNA 基因序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中已存在序列進行Blast分析，利用Phylip軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株的分類地位。

1.2.4 菌株降解能力測定

將菌株接入2216E液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)過夜，取對數(shù)生長期的菌體，按照2%(體積比)的接種量接入大生活用海水中，在37 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)48 h，測定培養(yǎng)液COD的變化。COD測定采用重鉻酸鉀法[14]。

1.2.5 菌株降解特性的研究

為研究菌株對含鹽污水的降解特性，分別以5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0作為pH值實驗組；分別以15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃作為溫度實驗組；分別以0、2%、4%、6%、8%、10%、12%作為NaCl濃度實驗組，考察環(huán)境因子對菌株生長和COD去除的影響。以上各實驗組大生活用海水量均為100 mL，培養(yǎng)條件為37 ℃、160 r·min-1恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)48 h后測定COD和OD600值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株分離與篩選

經(jīng)過5次富集馴化培養(yǎng)后，得到耐鹽混合菌群培養(yǎng)液。將混合培養(yǎng)物在2216E平板上劃線分離，經(jīng)過復篩、純化后得到5株耐鹽菌。其中一株對大生活用海水COD有較高去除率，編號為NY0935。

2.2 菌株NY0935的菌落形態(tài)及生理生化特征

菌株NY0935在2216E固體培養(yǎng)基上37 ℃培養(yǎng)2 d后菌落呈淺黃色，圓形且不透明。在原子力顯微鏡下觀察，菌體呈長桿狀，大小為1.3 μm×0.6 μm，見圖1。

圖1 菌株NY0935的原子力顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 AFM Photos of strain NY0935

生理生化實驗表明，菌株NY0935能還原硝酸鹽，氧化酶、過氧化氫酶實驗為陽性，脲酶實驗為陽性，吲哚反應為陰性，能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，精氨酸雙水解反應為陽性，能利用D-葡萄糖、D-甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺、D-麥芽糖、葡萄糖酸鉀、蘋果酸、檸檬酸三鈉、苯乙酸、L-阿拉伯糖、D-甘露醇為碳源。

全細胞脂肪酸分析結(jié)果顯示，菌株NY0935以十八碳烯酸(C18：1)和十六碳烯酸(C16：1)為主要成分，含量分別為35.83%和30.12%。

菌株NY0935的API ZYM 19種酶活檢測、API 20NE 21項指標檢測結(jié)果分別見表1、表2。

2.3 菌株NY0935的16S rDNA鑒定

菌株NY0935的16S rDNA基因序列在GenBank中的登錄號為GQ922076。將其與GenBank中已收錄的16S rDNA序列進行同源性比較發(fā)現(xiàn)，菌株NY0935的16S rDNA基因序列與Zobellellataiwanensisstrain ZT1(GenBank登錄號為DQ195676.1)序列相似度為99%。

通過與數(shù)據(jù)庫同源性較高的模式菌株進行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，發(fā)現(xiàn)NY0935與Zobellellasp.菌株在同一分支上。細菌分類學家認為當某2種細菌的16S rDNA相似度大于95%時，可以將其歸為同一屬。結(jié)合生理生化及分子鑒定結(jié)果，將菌株NY0935鑒定為卓貝爾氏菌屬(Zobellellasp.)。

表1APIZYM19種酶活檢測結(jié)果

Tab.1Analysis results of enzymatic activity for 19 kinds of enzyme by API ZYM

注：“0”代表陰性；“1”和“2”代表弱陽性；“5”代表陽性

表2API20NE21項指標檢測結(jié)果

Tab.2Analysis results of 21 indexes by API 20NE

注：“+”代表陽性；“-”代表陰性；“W”代表弱陽性

圖2 菌株NY0935的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of strain NY0935

2.4 菌株NY0935對大生活用海水COD的去除效果

將菌株NY0935按照2%(體積比)的接種量接入大生活用海水中，對COD的去除效果見圖3。

圖3 菌株NY0935對大生活用海水COD的去除Fig.3 The COD removal of seawater for routine life by strain NY0935

從圖3可以看出，菌株NY0935對大生活用海水的凈化效果明顯。隨著菌株NY0935的生長，培養(yǎng)24 h后COD濃度從305.6 mg·L-1降低到118.8 mg·L-1，培養(yǎng)48 h后COD去除率達75.99%。

2.5環(huán)境因子對菌株NY0935生長和COD去除的影響

2.5.1 溫度對菌株NY0935生長和COD去除的影響

溫度是影響微生物生長繁殖的重要因素，能直接影響菌體內(nèi)部酶的活性，從而影響生物體的生命活動。考察溫度對菌株NY0935生長和COD去除的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對菌株NY0935生長和COD去除的影響Fig.4 Effect of temperature on growth of strain NY0935 and removal of COD

從圖4可以看出，菌株NY0935的溫度適應范圍較廣，在15～40 ℃范圍內(nèi)均能正常生長，其生長較適宜的溫度為25～37 ℃，該范圍內(nèi)溫度對菌株生長和COD去除影響不大，在COD初始濃度為324.5 mg·L-1時，COD的去除率均達到62%以上，且菌株的OD600值均達到0.8以上。

2.5.2 pH值對菌株NY0935生長和COD去除的影響

微生物的生理活動和環(huán)境的酸堿度密切相關(guān)，只有在適宜的酸堿度條件下，微生物才能進行正常的生理活動。不同微生物有不同的pH值適應范圍，大多數(shù)細菌適應中性環(huán)境和偏堿性環(huán)境?？疾靝H值對菌株NY0935生長和COD去除的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對菌株NY0935生長和COD去除的影響Fig.5 Effect of pH value on growth of strain NY0935 and removal of COD

從圖5可以看出，pH值對菌株NY0935的生長和COD去除影響較大。pH值在6.0～10.0范圍內(nèi)，菌株NY0935生長較好，OD600和COD去除率分別達0.85和62.2%以上；當pH值低于5.0或大于11.0時，菌株NY0935幾乎不能生長，COD去除率很低。因此，在含鹽污水處理過程中保持適宜的pH值十分重要，在本實驗條件下，適宜的pH值范圍為6.0～10.0。

2.5.3 NaCl濃度對菌株NY0935生長和COD去除的影響

微生物對環(huán)境鹽度變化較為敏感，鹽度升高會改變滲透壓使微生物的細胞膜破裂，失去活性，降低處理效果?？疾霳aCl濃度對菌株NY0935生長及COD去除的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 NaCl濃度對菌株NY0935生長和COD去除的影響Fig.6 Effect of NaCl concentration on growth of strain NY0935 and removal of COD

從圖6可以看出，NaCl濃度在0～6%范圍內(nèi)，菌株NY0935能夠較好地生長，對COD保持較高的去除率。隨著NaCl濃度的升高，菌株生長量減少、COD去除率降低，在NaCl濃度大于12%的情況下，菌株完全不生長。菌株在NaCl濃度為4%時生長最好，OD600達0.881，說明菌株的生長需要一定的鹽度，屬于廣域嗜鹽菌。

3 結(jié)論

從塘沽海灘泥樣中分離、篩選出菌株NY0935，將菌懸液按2%(體積比)投加量投加到大生活用海水中，可以顯著提高含鹽污水中有機物的去除率，48 h后COD去除率達75.99%。通過形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA基因序列分析，將NY0935鑒定為卓貝爾氏菌屬(Zobellellasp.)。目前尚無該屬菌株用于含鹽污水處理的報道，這拓寬了人們對卓貝爾氏菌屬在其功能方面的應用研究思路，并為含鹽污水處理提供了高效菌種，具有較高的實用價值。

通常情況下，微生物降解有機物能力與環(huán)境pH值、溫度等均有一定的關(guān)系，在自然環(huán)境中的降解能力還會受其它微生物的影響。本研究結(jié)果表明，菌株NY0935在溫度為25～37 ℃、pH值為6.0～10.0、NaCl濃度為0～6%的范圍內(nèi)生長不受影響，說明菌株NY0935的適應pH值、溫度、鹽度等環(huán)境范圍較寬，可以在自然環(huán)境中發(fā)揮其降解功能，在處理含鹽有機污水方面具有廣闊的應用前景。

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StudyonIsolationandIdentificationofASalinityWastewaterDegradingBacterialStrainandItsDegradingCharacteristics

ZHANG Xiao-qing，YANG Bo，JIANG Tian-xiang，ZHANG Yu-shan，WANG Jing

(InstituteofSeawaterDesalinationandMulti-PurposeUtilization,SOA,Tianjin300192,China)

A salt-tolerant bacterial strain named NY0935 was isolated from a soil sample which was collected from Tanggu,China.The strain NY0935 was identified asZobellellasp.by analysis of morphological features,physiological and biochemical characteristics,as well as phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences.There was little effect on the growth of strain NY0935 under the culture conditions of 25～37 ℃,pH value of 6.0～10.0 and NaCl concentration of 0～6%.The COD removal rate was 75.99% when the strain NY0935 was cultured in the seawater for routine life for 48 h under the conditions of 37 ℃ and 160 r·min-1.

isolation and identification;salt-tolerant bacterial strain;degrading characteristic;COD

X 172

A

1672-5425(2013)12-0048-05