段曉穎，周艷梅，閆艷倉(cāng)，郝亞潔，劉曉龍

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450000)

野菊花總黃酮口腔生物黏附片是一種具有生物黏附作用的雙層貼片，用于治療口腔潰瘍，它由具生物黏附性的載藥層和不具生物黏附性的背襯層復(fù)合而成，載藥層的主要成分是黃酮類化合物，包括蒙花苷、木犀草苷、大波斯菊苷、木犀草素、芹菜素、刺槐素等，其中以蒙花苷為主要成分［1-4］。野菊花的臨床應(yīng)用十分廣泛［5-6］，研究表明，野菊花主要成分總黃酮具有抗菌［7-8］、抗炎［9-11］、抗病毒［12-13］、鎮(zhèn)痛及免疫調(diào)節(jié)［14-15］等生物活性。為更好控制該制劑的質(zhì)量，依據(jù)《中國(guó)藥典》2010年版項(xiàng)下有關(guān)測(cè)定方法，對(duì)野菊花中蒙花苷進(jìn)行了TLC鑒別，并采用UV、HPLC法對(duì)野菊花中的總黃酮、蒙花苷進(jìn)行了定量測(cè)定。

1 儀器與試藥

LC—10AVP高效液相色譜儀(日本島津);TU—1800PC紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);AEL—200電子天平(日本島津);Sartorius CP225D電子天平(德國(guó)賽多利斯);HK250科導(dǎo)臺(tái)式超聲波清洗器(上海漢克科學(xué)儀器有限公司);DZKW—C電子恒溫水浴鍋(北京科偉永興有限公司);野菊花對(duì)照藥材(批號(hào):120995-200704中國(guó)藥品生物制品檢定所);野菊花總黃酮生物黏附片(批號(hào)為 20100917、20101017、20101019，自 制);蘆 丁 (批 號(hào)100080-200707，中國(guó)藥品生物制品檢定所);蒙花苷(批號(hào)111528-200605，中國(guó)藥品生物制品檢定所);水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 供試品溶液的制備 取本品20片，研細(xì)，取約1 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取蒙花苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 對(duì)照藥材溶液的制備 取野菊花對(duì)照藥材0.3 g，加甲醇15 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.4 薄層色譜 吸取上述3種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15∶15∶6∶4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁溶液，熱風(fēng)吹干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。如圖1所示。

圖1 野菊花的薄層色譜Fig.1 TLC chromatogram of Chrysanthemi lndici Flos

3 定量測(cè)定

3.1 總黃酮測(cè)定

3.1.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇約30 mL，置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含無(wú)水蘆丁0.2 mg的對(duì)照品溶液，備用。

3.1.2 供試品溶液 取同一批野菊花總黃酮口腔生物黏附片20片，搗碎后研細(xì)，取約25 mg，精密稱定，加水超聲提取10 min，冷卻，定容于25 mL量瓶中，得供試品液，備用。

3.1.3 線性關(guān)系的考察 吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL具塞試管中，各管加水至6.0 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉溶液10.0 mL，加水至刻度，搖勻，放置15 min，在510 nm處測(cè)吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程 A=1.07×10－2+1.10×10－2C，r=0.9991，蘆丁溶液在9.81～58.85μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

3.1.4 精密度考察 吸取供試品溶液6份，每份5.0 mL，置25 mL具塞試管中，依標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法，分別在510 nm下測(cè)定吸光度。測(cè)得6次吸光度的RSD為1.02%，表明精密度良好。

3.1.5 穩(wěn)定性考察 吸取供試品供試品溶液5.0 mL，置25 mL具塞試管中，定容，依標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法，分別在10、20、30、40、50、60 min測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為1.79%，表明供試品溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按3.1.1項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，精密吸取供試品溶液5 mL，置25 mL具塞試管中，依標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法，測(cè)定，計(jì)算，RSD為2.36%，表明重復(fù)性良好。

3.1.7 回收率試驗(yàn) 稱取蘆丁對(duì)照品適量，配制成質(zhì)量濃度為0.8356 mg/mL的對(duì)照品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)加樣貯備液。稱取已知含有量的樣品9份，每份12.5 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別精密加入質(zhì)量濃度為0.8356 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，制成高中低3種不同質(zhì)量濃度的溶液9份，各精密吸取5 mL，置25 mL具塞試管中。以標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算，平均回收率為99.12%，RSD為1.95%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)Tab.1 Results of recorery tests

3.1.8 樣品測(cè)定 分別稱取3批樣品各3份，每份約25 mg，加水超聲提取10 min，冷卻，定容于25 mL量瓶中，得供試品液。精密吸取供試品溶液5 mL，置25 mL具塞試管中，依標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法，計(jì)算，3批供試品平均含有量分別為9.21%、9.32%、9.41%。

3.2 蒙花苷測(cè)定

3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 稱取蒙花苷對(duì)照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含蒙花苷0.1924 mg)。

3.2.2 供試品溶液的制備 取本品20片，研細(xì)后，混勻，取約50 mg，稱定，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)15 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

3.2.3 色譜條件 Agilent XDB-C18色譜柱(5μm，4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸(26∶23∶1);檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm;體積流量1 mL/min;柱溫25℃;進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 黏附片中蒙花苷高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of linarin(A)and sample(B)

3.2.4 線性關(guān)系的考察 吸取蒙花苷對(duì)照品溶液(0.1924mg/mL)0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成對(duì)照品溶液。按上述色譜條件，分別吸取對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀中，測(cè)定峰面積，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，蒙花苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸得蒙花苷線性方程為:Y=22748753X+19982，r=0.9995。結(jié)果表明蒙花苷進(jìn)樣量在0.096～1.924μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

3.2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 吸取質(zhì)量濃度為0.3848 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得蒙花苷色譜峰峰面積RSD為0.31%，表明儀器精密度良好。

3.2.6 穩(wěn)定性考察 吸取供試品溶液10μL，分別在0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定蒙花苷色譜峰峰面積，計(jì)算峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.67%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2.7 重復(fù)性考察 稱取同一批號(hào)供試品5份，每份各約50 mg，按3.2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算，蒙花苷的平均含有量為3.05%，RSD為0.7%。表明重復(fù)性良好。

3.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取蒙花苷對(duì)照品適量，配制成0.338 mg/mL的對(duì)照品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)加樣貯備液。稱取已知含有量的黏附片粉末25.0 mg，平行9份，分別加入上述標(biāo)準(zhǔn)加樣貯備液，制備成高、中、低3種不同質(zhì)量濃度的9份溶液，按供試品溶液制備方法制成加樣回收液。分別吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蒙花苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery tests

3.2.9 樣品測(cè)定 分別稱取3批供試品，按3.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10μL，依上法測(cè)定，計(jì)算，蒙花苷的含有量分別為3.079%、3.079%、3.077%。

4 討論

4.1 近年來(lái)，生物黏附制劑發(fā)展較為迅速，野菊花總黃酮口腔生物黏附雙層片屬于該類制劑。它的特點(diǎn)是可持續(xù)單向釋藥，生物黏附層能較好地黏附于口腔潰瘍患處，背襯層則起到賦形作用，大大延長(zhǎng)載藥面對(duì)潰瘍面的覆蓋和黏附時(shí)間，保護(hù)創(chuàng)面，同時(shí)還可阻斷外界因素對(duì)潰瘍面的刺激，減輕患者痛苦。該劑型使藥物僅向內(nèi)側(cè)釋放，減輕藥物不適口味，增大藥物濃度梯度，使藥物緩慢釋放和吸收，達(dá)到長(zhǎng)效目的，發(fā)揮最佳治療作用。

4.2 通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了本制劑中野菊花總黃酮的薄層鑒別方法，采用UV法和HPLC法分別測(cè)定總黃酮和蒙花苷的量，經(jīng)方法學(xué)考察，證明方法靈敏、專屬、快速，可作為該口腔生物黏附雙層片的質(zhì)量控制方法。

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