王瑋鵬 苗芳芳 武丹丹 楊軍 王志鋼

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古呼和浩特市環(huán)境科學(xué)研究所，呼和浩特 010030）

隨著蛋白分離技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究獲得的海量信息，對(duì)蛋白質(zhì)的研究已從蛋白質(zhì)化學(xué)發(fā)展到蛋白質(zhì)組學(xué)的研究階段，并成為21 世紀(jì)生命科學(xué)的重要技術(shù)支撐和戰(zhàn)略前沿。蛋白質(zhì)組學(xué)中的蛋白質(zhì)鑒定、定量以及相互作用的研究已實(shí)現(xiàn)了其對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和相關(guān)通路機(jī)制的研究作出貢獻(xiàn)的早期設(shè)想。新的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在很大程度上推進(jìn)了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的深入，闡明了細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是通過蛋白質(zhì)間相互作用（protein-protein interaction）從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞的機(jī)制。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步確定各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的未知分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)這些通路之間的聯(lián)系（cross-talk）及所構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)更深入的認(rèn)識(shí)是目前的研究熱點(diǎn)。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念與技術(shù)

1.1 蛋白質(zhì)組學(xué)的定義

1994 年澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams等在意大利的第一屆Siena會(huì)議上首次提出了蛋白質(zhì)組（Proteome）這個(gè)概念，并最初定義為“一個(gè)基因組所表達(dá)的蛋白質(zhì)”［1］。目前認(rèn)為蛋白質(zhì)組是指一個(gè)基因組所編碼的全部蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)組學(xué)是指利用直接測定和鑒別蛋白質(zhì)的高通量方法，大規(guī)模研究蛋白質(zhì)組的表達(dá)動(dòng)力學(xué)和蛋白質(zhì)相互作用。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究細(xì)胞和組織中全部蛋白質(zhì)的科學(xué)，試圖通過蛋白質(zhì)組學(xué)的研究從細(xì)胞水平及整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律，從而深入認(rèn)識(shí)有機(jī)體的各種生理和病理過程。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域與技術(shù)

對(duì)蛋白質(zhì)組的功能分析是功能基因組學(xué)的核心。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究一般可以劃分為3個(gè)領(lǐng)域：一是蛋白質(zhì)鑒定和分析；二是不同生長條件下蛋白質(zhì)的泛蛋白質(zhì)組（proteome-wide）差異顯示；三是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。其運(yùn)用的技術(shù)主要是蛋白質(zhì)分離與鑒定技術(shù)，同時(shí)生物信息學(xué)技術(shù)也是蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)中不可或缺的部分。

傳統(tǒng)蛋白質(zhì)研究方法的單一應(yīng)用已經(jīng)不能滿足目前對(duì)蛋白質(zhì)組研究的要求，在已有方法的基礎(chǔ)上將其整合與創(chuàng)新，已經(jīng)形成了系統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)分離與鑒定、蛋白質(zhì)相互作用與修飾及定量研究技術(shù)。對(duì)蛋白質(zhì)樣品的制備通常從樣品的預(yù)分級(jí)開始。常用的預(yù)分級(jí)方法如二維高效液相色譜、液相等電聚焦及膜電泳，亞細(xì)胞分級(jí)與單細(xì)胞水平樣品制備等，主要用以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測靈敏度，并且可以針對(duì)某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。蛋白質(zhì)的分離與鑒定是預(yù)分級(jí)處理后蛋白質(zhì)組學(xué)研究中極為重要的一環(huán)，雙向凝膠電泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC） 是 目 前常用的方法，毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）則是經(jīng)典電泳技術(shù)與現(xiàn)代微柱分離技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，具有極高的分辨率，而毛細(xì)管色譜（capillary electro chromatography，CEC）則同時(shí)具有毛細(xì)管電泳的高效分離性和HPLC的高效選擇性。

蛋白質(zhì)鑒定的主要手段之一便是生物質(zhì)譜（Biomass spectrometry，Bio-MS），Bio-MS是通過制備、分離、檢測氣相生物大分子來鑒定化合物的高通量技術(shù)，具有較高特異性與靈敏性。液質(zhì)連用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS） 是 以 液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)分析的綜合技術(shù)，它綜合了液相色譜較寬的分離范圍特性與MS的高選擇性和高靈敏度的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)很好的鑒定效果。在此基礎(chǔ)上建立的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)則將液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，檢測樣品即使在液相色譜難分離的情況下，只要通過多級(jí)質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行的中性碎片掃描，即可發(fā)現(xiàn)并突出混和物中的目標(biāo)化合物，提供更精確的鑒定效果。此外，近年基體輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（matrixassisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）、Shotgun混 合 蛋 白鑒定技術(shù)及蛋白質(zhì)從頭測序（De-novo）等技術(shù)在未知樣品分析及翻譯后修飾鑒定中得到了廣泛應(yīng)用。同時(shí)，蛋白質(zhì)定量技術(shù)近年也逐步發(fā)展起來，一是基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色基礎(chǔ)上的定量，如雙向熒光差異凝膠電泳（two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，DIGE），通過三色熒光染料分別對(duì)內(nèi)標(biāo)和生物樣本進(jìn)行標(biāo)記，再通過圖像分析準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白；另一是基于質(zhì)譜檢測技術(shù)的定量，包括采用差異同位素標(biāo)記的相對(duì)定量技術(shù)，如ICAT（isotope-coded affinity tag）、SILAC（stable isotope labeling with amino acids in cell）和iTRAQ（isobaric tags for relative and absolute quantitation）等，以及含有特定同位素的目標(biāo)肽段的絕對(duì)定量技術(shù)。值得注意的是，高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用是與生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展分不開的，蛋白質(zhì)定性與定量測定結(jié)果的分析依賴于生物信息學(xué)建立起來的計(jì)算模型和數(shù)據(jù)庫，尤其是未知蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測更離不開生物信息學(xué)的支持。

2 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與分子調(diào)控

細(xì)胞生長調(diào)控是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜過程，它不僅受到時(shí)間和空間的限制，還受到營養(yǎng)條件和細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境條件的影響。盡管目前對(duì)細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)機(jī)制了解得很少，但它已經(jīng)成為了現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)的研究重點(diǎn)，同時(shí)也取得了許多重大進(jìn)展。細(xì)胞內(nèi)存在許多不同的信號(hào)通路來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外刺激所引發(fā)的反應(yīng)，并介導(dǎo)細(xì)胞的代謝、增殖、分化、遷移、周期阻滯或凋亡等生物學(xué)過程。信號(hào)分子是細(xì)胞的信息載體，種類繁多。信號(hào)分子與靶細(xì)胞表面受體或胞內(nèi)受體的特異性結(jié)合將受體活化后可以啟動(dòng)靶細(xì)胞內(nèi)一條或多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而引發(fā)細(xì)胞代謝或基因表達(dá)的改變，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長與分化［2］。

盡管不同的信號(hào)通路具有各自不同的調(diào)節(jié)機(jī)制，但準(zhǔn)確的信號(hào)傳遞則需要各個(gè)通路之間的交叉作用（cross-talk）從而進(jìn)一步形成復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)（intracellular network）。隨著細(xì)胞內(nèi)新的信號(hào)分子的不斷發(fā)現(xiàn)和鑒定，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)愈加復(fù)雜，針對(duì)單一信號(hào)分子的研究技術(shù)和方案已難于滿足對(duì)細(xì)胞生理活動(dòng)的全面了解的需要。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用為我們揭示了細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，鑒定信號(hào)分子復(fù)合物，探討蛋白質(zhì)間相互作用的分子基礎(chǔ)，新伴侶分子的發(fā)現(xiàn)，以及已知通路之間的交叉和實(shí)現(xiàn)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的動(dòng)態(tài)變化研究提供了重要手段。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用

3.1 在蛋白質(zhì)之間相互作用中的應(yīng)用

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）和酵母雙雜交技術(shù)是研究蛋白之間相互作用的基本方法。Co-IP是用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來的技術(shù)，這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。酵母雙雜交技術(shù)則是在單細(xì)胞真核生物酵母在體內(nèi)利用“誘餌蛋白”（bait）捕獲“獵物蛋白”（prey），二者在細(xì)胞內(nèi)相互作用后形成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物從而啟動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)。此外，融合蛋白沉降技術(shù)與免疫熒光技術(shù)也廣泛適用于蛋白質(zhì)相互作用的研究。pull-down技術(shù)是利用GST對(duì)谷朧甘膚偶聯(lián)球珠的親和性，從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白，常采用原核表達(dá)純化技術(shù)，適用于體外研究蛋白質(zhì)在溶液中的相互作用。近年單分子操作技術(shù)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）技術(shù)也有應(yīng)用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用研究的報(bào)道，使得蛋白之間的相互作用檢測實(shí)現(xiàn)了直接可測。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)目前得以廣泛應(yīng)用，可將待檢測的蛋白混合樣品與結(jié)合到固相基質(zhì)上的蛋白質(zhì)相雜交，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)未知蛋白的分離和鑒定。由于蛋白質(zhì)芯片的高特異性和敏感性，結(jié)合質(zhì)譜、熒光、顯色等方法可以直接或間接地鑒定出與靶蛋白相結(jié)合的蛋白質(zhì)，適用于高通量的蛋白質(zhì)表達(dá)譜分析。

蛋白質(zhì)復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)行使多種功能。鑒定蛋白質(zhì)復(fù)合體的亞基是理解蛋白質(zhì)復(fù)合體功能的基礎(chǔ)。Guerrero等［3］發(fā)明了一種體內(nèi)串聯(lián)親和純化交聯(lián)蛋白質(zhì)復(fù)合體的定量分析（quantitative analysis of tandem affinity purified in vivo cross-linked（X）protein complexes，QTAX）技術(shù)來描述體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用（protein-protein interaction，PPI），并利用這一策略成功繪制了酵母中26S蛋白酶體（細(xì)胞內(nèi)降解蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合體）的相互作用網(wǎng)絡(luò)。26S蛋白質(zhì)復(fù)合體中有64對(duì)潛在的PPI，其中42對(duì)是新發(fā)現(xiàn)的相互作用。

較為復(fù)雜的研究則包括許多非常規(guī)的蛋白質(zhì)組學(xué)手段。例如，酵母是研究G-蛋白偶聯(lián)受體（G-protein coupled receptor，GPCR）信號(hào)通路的一種模式生物。GPCR研究為理解絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路包括交配信息素（mating pheromone）的應(yīng)答提供了基礎(chǔ)。Gruhler等使用13C6-Lysine和13C6-Arginine標(biāo)記，對(duì)賴氨酸和精氨酸營養(yǎng)缺陷型酵母交配信息素誘導(dǎo)的磷酸化改變進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析，用固定化金屬離子親和層析（immobilized metal ion affinity chromatography，IMAC）富集磷酸化肽段；在離子阱（ion trap）中大量發(fā)生中性丟失的離子可被進(jìn)一步分離、碎裂和分析，這稱為MS/MS/MS（MS3）。準(zhǔn)確的母離子質(zhì)量結(jié)合MS3圖譜信息，可以提高幾個(gè)數(shù)量級(jí)的磷酸肽鑒定可信度。該研究以混合線性離子阱-傅立葉變換粒子回旋共振（linear ion trap-Fourier transform ion cyclotron resonance，LTQ-FTICR）質(zhì)譜儀進(jìn)行MS/MS和中性丟失導(dǎo)向（neutral lossdirected）的MS3分析，提高對(duì)磷酸肽檢測及鑒定的靈敏度和準(zhǔn)確性。利用MS/MS掃描自動(dòng)觸發(fā)數(shù)據(jù)依賴的MS3對(duì)中性丟失的母離子進(jìn)行碎裂，這一中性丟失依賴的MS3運(yùn)行模式會(huì)出現(xiàn)特征性磷酸丟失（-98 Da），通過2次連續(xù)的串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)磷酸肽進(jìn)行測序。共鑒定了700個(gè)磷酸肽，其中139個(gè)表達(dá)變化在2倍以上，主要是MAPK信號(hào)通路成員［4］。

3.2 在分子伴侶研究中的應(yīng)用

分子伴侶是存在于細(xì)胞中，幫助蛋白質(zhì)正確折疊使之正常行駛功能的小分子蛋白質(zhì)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要意義。近幾年應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在分子伴侶的相關(guān)研究中取得了較大的進(jìn)展（表 1）。

3.3 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間的關(guān)聯(lián)與機(jī)制研究中的應(yīng)用

細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)是細(xì)胞通過胞外或胞內(nèi)的刺激后，激活受體而改變細(xì)胞內(nèi)生理機(jī)能的過程，這種刺激可以是很小的分子、蛋白、甚至是光子，細(xì)胞經(jīng)過刺激后通過基因表達(dá)水平的改變對(duì)外界刺激做出回應(yīng)。通過對(duì)調(diào)節(jié)生長發(fā)育起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路分子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)答過程不是一條通路的作用結(jié)果，而是不同通路之間交互的調(diào)控作用結(jié)果［11］。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，對(duì)于細(xì)胞通路的交叉作用的研究顯得極為重要。通過研究不同通路之間的交叉作用，發(fā)現(xiàn)了一些重要通路間的交叉位點(diǎn)（表2）。

4 小結(jié)

雖然蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)給相關(guān)研究帶來了許多指導(dǎo)性的結(jié)果，但是相關(guān)的技術(shù)仍具有很大的發(fā)展空間。首先是蛋白質(zhì)的分析與鑒定方面，將某個(gè)蛋白質(zhì)組樣品中的所有蛋白質(zhì)分離并檢測仍然是不現(xiàn)實(shí)的，目標(biāo)蛋白質(zhì)過低的豐度，特殊的蛋白質(zhì)修飾等都對(duì)此技術(shù)的發(fā)展造成了阻礙。這樣便限制了對(duì)未知的細(xì)胞信號(hào)通路中或已知的通路中未知蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)。此外，將一個(gè)蛋白質(zhì)相互作用組與另一個(gè)相比較幾乎是不可實(shí)現(xiàn)的，兩個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)間的比較仍然沒有很好的方法能夠完成，這限制了信號(hào)通路間交叉作用的研究。倘若這一技術(shù)得到發(fā)展，兩個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)的差異得以方便地確定，則會(huì)大大增進(jìn)通路間交叉作用的新發(fā)現(xiàn)。

表2 應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)的重要通路交叉位點(diǎn)及相關(guān)功能

未來蛋白質(zhì)組學(xué)在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中可能會(huì)更加側(cè)重于生命體依賴的復(fù)合物、通路以及網(wǎng)絡(luò)的形式來協(xié)調(diào)蛋白質(zhì)之間的相互作用的研究方向。例如，目前通路間的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)相對(duì)靜態(tài)的連線圖，需要將基因敲除及系統(tǒng)擾動(dòng)等數(shù)據(jù)加入進(jìn)來，以期認(rèn)識(shí)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的本質(zhì)，發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的核心。除此之外，如何在不影響細(xì)胞的正常生理?xiàng)l件下的活細(xì)胞分析及檢測動(dòng)態(tài)的蛋白間相互作用仍然會(huì)是研究的熱點(diǎn)。

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