佘 芹, 尹玉竹, 郝秀蘭， 章 鈞, 侯紅瑛

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科, 廣東 廣州 510630)

正常整倍體及21三體胎盤組織的甲基化標志物研究*

佘 芹#, 尹玉竹△, 郝秀蘭， 章 鈞, 侯紅瑛

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科, 廣東 廣州 510630)

目的聯(lián)合應(yīng)用甲基化特異性多重連接依賴的探針擴增技術(shù)(MS-MLPA)及亞硫酸氫鹽測序2種方法進行胎盤組織甲基化研究，以尋找可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21三體綜合征的甲基化標志物。方法用MS-MLPA和亞硫酸氫鹽測序2種方法對15例正常整倍體孕婦和11例21三體孕婦的胎盤組織，以及13例非孕婦女外周血進行甲基化檢測，并計算候選的3個基因(4個位點)CGI149、CGI045、HLCS-1和HLCS-2的甲基化率。結(jié)果(1)MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測序所測得的甲基化率一致。(2)所選的4個位點，在13例非孕婦女外周血樣本中CGI149、CGI045和HLCS-2三個位點均未甲基化；在15例整倍體胎盤中，CGI149有13例(2例未甲基化)、CGI045有11例(4例未甲基化)、HLCS(包括HLCS-1和HLCS-2)有15例甲基化；在11例21三體胎盤中，CGI149有10例(1例未甲基化)、CGI045及HLCS(包括HLCS-1和HLCS-2)均有11例甲基化。只有HLCS-2符合在所有外周血細胞中均未甲基化，在所有胎盤組織中均甲基化。比較4個位點的甲基化率在正常整倍體胎盤與21三體胎盤的不同，只有CGI149有統(tǒng)計學(xué)意義，其它3個位點(CGI045、HLCS-1和HLCS-2)均無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論(1)MS-MLPA可代替亞硫酸氫鹽測序用于胎盤的甲基化研究。(2)本研究所選擇的CGI045、CGI149、HLCS-1和HLCS-2不適合用作21三體的甲基化標志物，需進一步尋找新的位點。

DNA甲基化； 21三體綜合征； 無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷； 亞硫酸氫鹽測序

21三體綜合征是人類最早發(fā)現(xiàn)且最常見的一種常染色體病，在活產(chǎn)嬰兒中的發(fā)病率約為1/600～1/800[1-2]。目前對21三體綜合征的產(chǎn)前診斷技術(shù)主要是絨毛活檢、羊膜腔穿刺以及臍血穿刺等有創(chuàng)性方法，可能對胎兒或孕婦造成一定的危害，因此從孕婦外周血中提取胎兒游離DNA進行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷成為研究熱點和方向。但母血中胎兒游離DNA僅占3%～6%[3]，因此，要將胎兒游離DNA從大量母體DNA背景中分離出來，必須采用特異、高效的胎兒DNA標志物，而母胎間存在甲基化差異的位點為解決上述問題提供了新的契機。

亞硫酸氫鹽測序是最經(jīng)典的甲基化研究方法，但其步驟繁瑣、昂貴、對DNA損耗大，限制了其在臨床中的廣泛運用，尤其不適合進行無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。2005年，Nygren等[4]改進多重連接依賴的探針擴增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)為甲基化特異性MLPA(methylation-specific MLPA,MS-MLPA)用于檢測特異位點的甲基化，為甲基化研究提供了一種新的方法。故本課題聯(lián)合應(yīng)用MS-MLPA及亞硫酸氫鹽測序2種方法進行胎盤組織甲基化研究，以尋找可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷 21三體綜合征的甲基化標記物。

材 料 和 方 法

1材料

1.1胎盤組織的獲取 取2011年1月至2012年3月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科因計劃外懷孕要求引產(chǎn)并經(jīng)羊水穿刺細胞培養(yǎng)證實為正常整倍體的孕婦15例，以及因唐氏高風(fēng)險(9例)、高齡妊娠(1例)、胎兒水腫綜合征而行羊水穿刺確診為21三體綜合征的孕婦11例，分娩后分別取其胎盤組織。取胎盤組織前均經(jīng)孕婦本人知情同意。

1.2非孕婦女外周血的獲取 選取在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科工作的正常未婚未孕婦女13例，留取其外周血2 mL。

2方法

2.1基因組DNA的提取

2.1.1胎盤組織DNA 娩出胎盤后即在胎兒面取直徑約1 cm的胎盤小葉，剪碎后用生理鹽水反復(fù)沖洗，取25 mg用于提取DNA。采用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)，按說明書操作提取DNA,測定所提DNA在260 nm和280 nm處的吸光度(A),計算DNA濃度及純度,要求A260/A280在1.8～2.0。使用pH為8.0的TE緩沖液將DNA稀釋至終濃度為100 mg·L-1。

2.1.2外周血DNA 用EDTA抗凝管取非孕婦女肘靜脈血2 mL，混勻后取200 μL用于提取DNA，步驟同上。

2.2亞硫酸氫鹽測序

2.2.1亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 取200～500 ng胎盤組織DNA，選用Zymo Research公司的EZ DNA Methylation-Direct? Kit，按照說明書操作進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化,取1 μL DNA進行下一步的PCR反應(yīng)。

2.2.2轉(zhuǎn)化后的DNA PCR擴增、克隆測序 按照下面的流程, 參照試劑說明書操作:以轉(zhuǎn)化后的DNA 為模板分別擴增3個基因(4個位點：CGI149、CGI045、HLCS-1和HLCS-2)的目的片段(引物見表1)，回收PCR 產(chǎn)物，用TaKaRa公司的pMD 18-T載體與PCR產(chǎn)物連接反應(yīng)，用TaKaRa公司的感受態(tài)大腸桿菌進行轉(zhuǎn)化，取400 μL菌液涂板后37 ℃溫箱孵育，每個基因挑選10個以上克隆進行酶切鑒定，陽性克隆取200 μL菌液送上海英駿生物公司測序。將每個克隆的測序結(jié)果去除載體和引物后, 以純文本格式保存,并與相應(yīng)的基因組序列文件放在同一目錄下。分析每個 CpG位點甲基化狀態(tài),并計算每個CpG位點的甲基化率。

表1 亞硫酸氫鹽測序引物

2.3MS-MLPA 選用MLPA Mental Retardation-1試劑盒(SALSA P300; MRC-Holland)，包括4個質(zhì)量控制探針、17個不含“GCGC”酶切位點的內(nèi)參照探針及1個含“GCGC”酶切位點的消化內(nèi)參照，探針序列詳見說明書。MS-MLPA操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行，本課題設(shè)計的目的探針見表2。取1 μL PCR產(chǎn)物使用ABI 3100測序儀進行位點分析，所得數(shù)據(jù)采用GeneMarker 1.71軟件處理, 得出每個探針的峰值高度，然后利用以下公式計算每個基因位點的甲基化率(methylation ratio,MR)。MR=(Hx/HCtrl)digested/(Hx/HCtrl)undigested[MR: 0～1.0(0～100%)；Hx：目的探針的峰值；HCtrl：所有內(nèi)參照探針(消化內(nèi)參照除外)的峰值之和；digested：HhaI消化后的樣本；undigested：未經(jīng)HhaI消化的樣本]。

表2 MS-MLPA寡核苷酸探針序列

3統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，用Shapiro-WilkW檢驗兩組(正常整倍體胎盤與21三體綜合征胎盤)定量資料的正態(tài)性，當兩組資料呈正態(tài)分布且方差齊時，用兩獨立樣本的t檢驗，否則用秩和檢驗。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1非孕婦女外周血細胞的甲基化檢測及MR截斷值的建立

首先用亞硫酸氫鹽測序方法對13例非孕婦女外周血樣本進行甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)在所選取的3個基因(4個位點)中，有3個位點(CGI149、CGI045和HLCS-2)未甲基化，而HLCS-1在1例(1/13)樣本中未甲基化，12例(12/13)樣本中甲基化，另外，有研究證實β-actin在胎盤及非孕婦女外周血中是完全未甲基化的[5]，故本課題選用β-actin作為消化內(nèi)參照并用亞硫酸氫鹽測序方法進行克隆驗證，證實所選取的β-actin目的片段完全未甲基化。之后將β-actin探針加入到SALSA MLPA P300A1 Reference-2中，對13例非孕婦女外周血樣本進行MS-MLPA檢測，發(fā)現(xiàn)當SALSA MLPA P300A1 Reference-2的消化內(nèi)參照消化完全時，β-actin的MR值波動在0～0.1之間,見圖1。因此，本研究認為，當MR>0.1，樣本甲基化，當≤0.1，樣本未甲基化?；诮財嘀?.1，我們用MS-MLPA方法對13例非孕婦女外周血樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)所選取的3個基因(4個位點)中，CGI149、CGI045和HLCS-2均未甲基化，見圖2，與亞硫酸氫鹽測序的結(jié)果一致。

2正常整倍體胎盤的甲基化檢測

用亞硫酸氫鹽測序和MS-MLPA兩種方法對15例正常整倍體胎盤進行甲基化檢測，在所選取的3個基因(4個位點)中，CGI149在13例樣本中甲基化而在2例樣本中未甲基化，CGI045在11例樣本中甲基化而在4例樣本中未甲基化，HLCS基因(包括HLCS-1及HLCS-2)在15例樣本中均甲基化，見圖2。MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測序檢測結(jié)果一致。

321三體胎盤的甲基化檢測

用2種方法對11例21三體胎盤進行甲基化檢測，在所選取的3個基因(4個位點)中，CGI149在10例樣本中甲基化而在1例樣本中未甲基化，CGI045及HLCS基因(包括HLCS-1及HLCS-2)在11例樣本中均甲基化，見圖2。MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測序檢測結(jié)果一致。

4比較4個位點的甲基化率在正常整倍體胎盤與21三體胎盤中的不同

將3個基因(4個位點)在正常整倍體胎盤及21三體胎盤的甲基化率進行比較，發(fā)現(xiàn)只有CGI149差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其它3個位點(CGI045、HLCS-1和HLCS-2)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

Figure 1. Non-pregnant woman blood cells analysed by MS-MLPA (A) and the methylation ratios of β-actin (B). When the digestion control (184 bp) was digested completely, the methylation ratios of β-actin in non-pregnant woman blood cells were 0～0.1.

圖1非孕婦女外周血MS-MLPA檢測示意圖及β-actin的甲基化率

Figure 2. The methylation ratios of the 4 fragments in blood cells from non-pregnant women (n=13)， and in placental tissues from euploid (n=15) and trisomy 21 (n=11) pregnant women. Mean±SD.

圖2非孕婦女外周血(13例)、正常整倍體孕婦胎盤組織(15例)和21三體孕婦胎盤組織(11例)4個位點的甲基化率

討 論

隨著DNA甲基化研究的深入，母胎間存在甲基化差異的基因，為21三體綜合征的無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷帶來了新的機遇。亞硫酸氫鹽測序是目前進行DNA甲基化研究的金標準，但其對DNA損耗大，而孕婦外周血中胎兒DNA含量僅3%～6%，顯然，亞硫酸氫鹽測序不適合用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。MS-MLPA是一種快速、高通量的定量技術(shù)，可以對基因的拷貝數(shù)和甲基化狀態(tài)同時進行檢測，它需要的樣本DNA量很少(20～200 ng)，也不需要對DNA進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，僅需要甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶對特異性的探針和DNA結(jié)合序列進行消化，另外，與亞硫酸氫鹽測序相比，MS-MLPA花費較低，且每次反應(yīng)可以多個位點同時進行，而亞硫酸氫鹽測序每次只能對1個樣本的1個位點進行克隆測序。因此本課題嘗試選用MS-MLPA對胎盤組織及外周血標本進行甲基化研究，以探討其可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MS-MLPA與亞硫酸氫鹽測序結(jié)果一致，因此我們認為MS-MLPA可以取代亞硫酸氫鹽測序?qū)μケP組織及外周血標本進行甲基化研究。

表3HLCS-1、HLCS-2、CGI149及CGI045的甲基化率在正常整倍體胎盤及21三體胎盤組織中的比較

Table 3. Comparison of DNA methylation ratios of HLCS-1,HLCS-2,CGI149 and CGI045 between euploid and trisomy 21 placental tissues

GroupnHLCS-1*HLCS-2*CGI149*CGI045#(Mean±SD)MedianP25～P75MedianP25～P75MedianP25～P75Euploidplacentaltissue150.71800.6045～0.74200.57670.4735～0.70490.45780.3568～0.51690.2602±0.1834Trisomy21placentaltissue110.75650.6043～0.84300.67720.5911～0.7177 0.5918△△0.5618～0.66590.3794±0.1679

*Kruskal-Wallis test was used;#ttest for two independent samples was used.△△P<0.01vseuploid placental tissue.

孕婦血漿中胎兒DNA[5]主要來源于胎盤，而21號染色體上理想的可用于無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21三體綜合征的胎盤特異性DNA甲基化標記物應(yīng)滿足以下3個條件：(1)所選的CpG位點在母體血細胞中完全未甲基化(MR≤0.1)；(2)在所有胎盤組織中甲基化(MR≥0.1)；(3)所選的CpG位點的甲基化率在正常整倍體和21三體綜合征胎盤組織之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2008年，Chim等[6]系統(tǒng)地分析了21號染色體長臂上的CpG島。在所研究的2 440個 CpG位點中，發(fā)現(xiàn)有255個CpG位點可以用于進一步研究。在這 255個CpG位點中，有127個CpG位點在胎盤組織中甲基化而在母體血細胞中完全未甲基化。在這127個CpG位點中，有29個CpG位點含甲基化敏感的HhaⅠ識別位點。我們在這29個位點中隨機選擇了2個位點(CGI045和CGI149)進行研究。2010年Tong等[7]再次使用COBRA方法研究21號染色體上的非CpG島，并成功地發(fā)現(xiàn)了一個新的甲基化區(qū)——HLCS基因啟動子區(qū)，該研究將HLCS基因啟動子區(qū)分為A、B1、B2三個區(qū)分別進行研究，其中，B2區(qū)中的CpG位點在胎盤組織中高甲基化而在外周血中低甲基化或未甲基化，在B2區(qū)中，共有37個CpG位點，在這37個CpG位點中有6個CpG位點含甲基化敏感的HhaI識別位點，我們在這6個位點中隨機選擇了2個位點(HLCS-1和HLCS-2)進行研究。

在研究選取的4個位點(CGI045、CGI149、HLCS-1和HLCS-2)中，我們發(fā)現(xiàn)CGI045、CGI149和HLCS-2在所有非孕婦女外周血細胞中均未甲基化，HLCS-1和HLCS-2在所有胎盤組織中均甲基化。因此，只有HLCS-2同時滿足條件(1)(在母體血細胞中完全未甲基化)和條件(2)(在所有胎盤組織中甲基化)。但是該基因在正常整倍體和21三體綜合征胎盤組織中的甲基化率比較上差異卻沒有統(tǒng)計學(xué)意義，因此不滿足條件(3)。另外，雖然CGI149在所有非孕婦女外周血細胞中均未甲基化，并且在正常整倍體和21三體綜合征胎盤組織中的甲基化率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時滿足條件(1)和(3)。但是，該位點有2例(2/15)整倍體胎盤樣品和1例(1/11)21三體胎盤樣品未甲基化，不滿足條件(2)。故我們選擇的3個基因(4個位點)均不能被用無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷21三體綜合征，結(jié)果與文獻[6-7]的研究不同，其原因可能與以下因素有關(guān)。(1)個體間的差異。因為DNA甲基化模式，可以受個體內(nèi)部和外部因素的影響。雙胞胎的研究已經(jīng)驗證了這一現(xiàn)象[8]。該研究選取同卵雙胎為研究對象，探討在環(huán)境因素改變后，雙胎之間部分基因的甲基化出現(xiàn)差別，進而導(dǎo)致對一些疾病的易感性不同。此外，2013年，Schroeder等[9]通過研究人類胎盤的甲基化組，發(fā)現(xiàn)37%的胎盤基因組具有部分甲基化區(qū)域。因此，胎盤在發(fā)育過程中，在個體內(nèi)、外環(huán)境因素的影響下，可能會出現(xiàn)通過給某個或某些DNA添加甲基或脫甲基來調(diào)控基因的表達，進而影響胎盤的發(fā)育及胎兒的生長發(fā)育。(2)母體因素：2012年，Wilhelm-Benartzi等[10]研究發(fā)現(xiàn)孕婦吸煙及酗酒會影響胎盤基因的甲基化狀態(tài)，進而影響胎兒的生長發(fā)育。Bouchard等[11]研究發(fā)現(xiàn)胎盤的甲基化水平與孕婦的血糖濃度相關(guān)。Gordon等[12]選取雙胎為研究對象再次證實胎盤的甲基化狀態(tài)受外界因素影響(宮內(nèi)環(huán)境或其它因素)。(3)妊娠并發(fā)癥：2011年，Kulkarni等[13]研究發(fā)現(xiàn)胎盤的甲基化狀態(tài)與子癇前期相關(guān)。2011年，Banister等[14]研究發(fā)現(xiàn)胎兒宮內(nèi)生長受限與胎盤的甲基化狀態(tài)相關(guān)。由于本研究納入的都是中孕期婦女，孕周小于28周，故尚不能排除是否會發(fā)生先兆子癇、胎兒宮內(nèi)生長受限等妊娠并發(fā)癥，是否會導(dǎo)致胎盤基因甲基化狀態(tài)的不同尚無法證實。

綜上所述，MS-MLPA檢測甲基化率結(jié)果可靠，可代替亞硫酸氫鹽測序用于胎盤的甲基化研究。本課題所選擇的CGI045、CGI149和 HLCS-1、HLCS2不適合用于21三體綜合征甲基化標記物，需進一步尋找新的位點。

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Methylationmarkersinplacentatissuesofeuploidandtrisomy21

SHE Qin, YIN Yu-zhu, HAO Xiu-lan, ZHANG Jun, HOU Hong-ying

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:yzzst2011@163.com)

AIM: To explore the DNA methylation markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21.METHODSThe DNA methylation ratios of 3 genes (4 fragments) on chromosome 21 (CGI149, CGI045, HLCS-1 and HLCS-2) in blood cells from 13 non-pregnant women, and in placental tissues from 15 euploid and 11 trisomy 21 pregnant women were measured using the methods of methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) and bisulfite sequencing in combination.RESULTSThe results obtained from MS-MLPA were consistent with the results from bisulfite sequencing. The fragments of CGI149, CGI045 and HLCS-2 were unmethylated in the non-pregnant woman blood cells. HLCS-1 and HLCS-2 were methylated in all euploid and all trisomy 21 placentae. CGI149 was methylated in 13 (13/15) of the euploid and 10 (10/11) of the trisomy 21 placental tissues. CGI045 was methylated in 11 (11/15) of the euploid and all the Trisomy 21 placental tissues. Only HLCS-2 was found to be methylated in all placental tissues but unmethylated in all non-pregnant woman blood cells. Only the DNA methylation ratio in CGI149 was significantly different between euploid and trisomy 21 placental tissue (P<0.05). No difference among HLCS-1, HLCS-2 and CGI045 was observed.CONCLUSIONMS-MLPA is an effective alternative to bisulfite sequencing for the assessment of methylation ratios in placental tissue. CGI149, CGI045, HLCS-1 and HLCS-2 are not appropriate DNA methylation markers for non-invasive prenatal diagnosis of trisomy 21.

DNA methylation; Trisomy 21; Non-invasive prenatal diagnosis; Bisulfite sequencing

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.029

1000- 4718(2013)11- 2076- 06

2013- 06- 20

2013- 09- 10

廣東省科技計劃項目(No.2010B060900031)

△通訊作者 Tel: 020-85252172; E-mail: yzzst2011@163.com

# 現(xiàn)在工作單位： 清遠市人民醫(yī)院