蒲桂梅， 楊 莉， 李玉蘋△， 陳成水， 蔣 磊

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1呼吸內(nèi)科， 2龍灣內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325000)

FHL1在香煙煙霧刺激的大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖與遷移中的作用*

蒲桂梅1， 楊 莉1， 李玉蘋1△， 陳成水1， 蔣 磊2

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院1呼吸內(nèi)科，2龍灣內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325000)

目的研究FHL1 (four-and-a-half LIM domain 1)在香煙煙霧提取物(CSE)刺激的大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMCs)增殖及遷移中的作用。方法原代培養(yǎng)PASMCs，分別予CSE及FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染干預(yù)，分為6組：空白組、陰性轉(zhuǎn)染組、FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組、CSE組、CSE+陰性轉(zhuǎn)染組和CSE+FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組。Real-time PCR法檢測FHL1 mRNA的表達(dá)，Western blotting法檢測FHL1 蛋白，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，Transwell 法測定細(xì)胞遷移。結(jié)果CSE刺激導(dǎo)致PASMCs增殖、遷移及FHL1蛋白表達(dá)增加 (P<0.01) ，但FHL1 mRNA的表達(dá)無明顯改變(P>0.05)。FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染PASMCs，可降低CSE所致的PASMCs增殖及遷移(P<0.01)。結(jié)論CSE可促進(jìn)PASMCs增殖與遷移以及FHL1蛋白的表達(dá)， 抑制FHL1蛋白的表達(dá)可減弱CSE對(duì)PASMCs增殖和遷移的作用。這些結(jié)果表明CSE促進(jìn)PASMCs增殖和遷移與FHL1蛋白有關(guān)。

FHL1蛋白； 吸煙； 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)相關(guān)的肺動(dòng)脈高壓不僅由慢性低氧導(dǎo)致的血管收縮所引起，肺血管重塑、心臟并發(fā)癥以及肺實(shí)質(zhì)的損傷也都共同參與了肺動(dòng)脈高壓的形成[1]。香煙煙霧暴露是COPD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。近年來，研究發(fā)現(xiàn)香煙煙霧暴露可以導(dǎo)致肺血管功能障礙和血管重塑[2-3]，進(jìn)而與COPD肺動(dòng)脈高壓的形成密切相關(guān)。香煙煙霧暴露的血管重塑主要表現(xiàn)為血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[2]。

FHL1(four-and-a-half LIM domain 1)存在于多種組織中,與人類特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、動(dòng)脈夾層、肥厚型心肌病、骨骼肌肌病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[4-8]。Kwapiszewska等[4]研究發(fā)現(xiàn)在低氧和野百合堿所致的肺動(dòng)脈高壓大鼠中，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)增殖和遷移增加的同時(shí)FHL1蛋白表達(dá)增加； 用FHL1 siRNA干預(yù)人原代PASMCs，可導(dǎo)致FHL1蛋白表達(dá)降低伴PASMCs增殖和遷移減弱；而在FHL1過表達(dá)的原代PASMCs中，其增殖和遷移明顯增加。然而，F(xiàn)HL1在香煙煙霧提取物(cigarette smoke extract, CSE)刺激引起的PASMCs增殖和遷移中會(huì)有何作用尚缺乏研究。本文就以此為切入點(diǎn)進(jìn)行如下研究。

材 料 和 方 法

1動(dòng)物與材料

清潔級(jí)雄性SD大鼠(約200 g)，購自溫州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查同意。PBS、膠原酶I、胎牛血清和DMEM液均為Gibco產(chǎn)品。兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體和小鼠抗大鼠FHL1單克隆抗體購自Abcam，小鼠抗大鼠β-actin抗體購自北京中杉，山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗小鼠Ⅱ抗均購自EarthOx。紅雙喜香煙(含焦油量13 mg，煙氣煙堿量1.2 mg，煙氣一氧化碳量14 mg)由上海卷煙廠生產(chǎn)。陰性siRNA序列(UUCUCCGAACGUGUCACGUTT)和FHL1 siRNA序列(UGCCAAGCAUUGCGUGAAA和CUAAGGAGG UGGACAUAA)由上海吉瑪公司合成。Lipofectamine RNAiMAX和SYBR Green試劑盒購自ABI。FHL1引物(上游5’-GTG CCC TTG TAC TCC ACG TT-3’，下游5’-GTG TCC AAG GAT GGC AAG AT-3’)和內(nèi)參照GAPDH引物(上游5’-ATG AGC CCC AGC CTT CTC CAT-3’ ， 下游5’-GGT CGG AGT CAA CGG ATT TG-3’)由上海生工生物工程公司合成。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)購自日本同仁公司。Transwell板購自Corning。

2大鼠遠(yuǎn)端PASMCs原代培養(yǎng)及鑒定

參照文獻(xiàn)[9]并稍作修改，超凈臺(tái)內(nèi)用纖維器械在PBS中取肺動(dòng)脈3級(jí)以下分支，刮除外膜及內(nèi)膜，膠原酶I消化法分離PASMCs。將消化的細(xì)胞裝入含10%胎牛血清DMEM液的培養(yǎng)瓶，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)、α-SMA免疫熒光法及免疫細(xì)胞化學(xué)法(1∶1 000)鑒定。原代培養(yǎng)至3～6代的PASMCs用于實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×107/L。分別予CSE及FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染干預(yù)，分為6組：空白組、陰性轉(zhuǎn)染組、FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組、CSE組、CSE+陰性轉(zhuǎn)染組及CSE+FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組。

3CSE制備及干預(yù)

CSE制備參照文獻(xiàn)[10]并作適當(dāng)修改。將去除過濾嘴的香煙點(diǎn)燃，負(fù)壓吸引香煙煙霧至裝有DMEM液的密閉玻璃瓶中，輕輕搖晃使其溶解，氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.4，超凈臺(tái)內(nèi)過濾除菌，即為CSE原液。使用時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需不同濃度，用含10%胎牛血清的DMEM液稀釋CSE原液，30 min內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。

4FHL1siRNA轉(zhuǎn)染

Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FHL1 siRNA至PASMCs，抑制FHL1 mRNA表達(dá)。3～6代的原代細(xì)胞懸液，每孔0.5 mL接種于24孔板，細(xì)胞在無雙抗的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。據(jù)Lipofectamine RNAiMAX產(chǎn)品說明操作，siRNA和Lipofectamine RNAiMAX用DMEM液稀釋后混合放置15～20 min用于轉(zhuǎn)染，經(jīng)再培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總RNA，72 h后提取細(xì)胞總蛋白。

5Real-timePCR法檢測FHL1mRNA

體系配制參照SYBR Green試劑盒說明進(jìn)行，選用GAPDH作為內(nèi)參照。反應(yīng)條件設(shè)置為：50 ℃ 2 min(1個(gè)循環(huán))；95 ℃ 10 min(1個(gè)循環(huán))；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min(40個(gè)循環(huán))；95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s(1個(gè)循環(huán))。數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

6Westernblotting法檢測FHL1蛋白

3～6代的原代細(xì)胞懸液，每孔2 mL接種于6孔板，實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后提取每組總蛋白。經(jīng)濃度測定及標(biāo)化后，取每組相同蛋白上樣量經(jīng)緩沖液稀釋，先后進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)至PVDF膜上的蛋白，用含5 %脫脂牛奶的TBST溶液封閉2 h，再用小鼠抗大鼠FHL1單克隆抗體(1∶1 000)于4 ℃孵育過夜，內(nèi)參照選用β-actin(1∶1 000)。次日， TBST溶液洗滌Ⅰ抗后，常溫下山羊抗小鼠Ⅱ抗孵育1 h， TBST溶液洗滌Ⅱ抗后， ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，暗室顯影定影，條帶掃描后行灰度分析。

7CCK8法檢測細(xì)胞增殖

3～6代的原代細(xì)胞懸液，每孔0.1 mL接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待長至50%～70%融合時(shí)進(jìn)行干預(yù)，后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加10 μL CCK-8，置入37 ℃、含5 %CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5～2 h，450 nm波長下檢測吸光度(A)。

8Transwell法測定細(xì)胞遷移

3～6代的原代細(xì)胞懸液，每孔0.5 mL接種于24孔板，干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108/L，每孔0.1 mL的只含DMEM培養(yǎng)液的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到小室中，下室每孔加0.5 mL含10 %胎牛血清的DMEM液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，甲醛固定、結(jié)晶紫染色后擦去小室上層細(xì)胞，顯微鏡下計(jì)數(shù)小室下層細(xì)胞，每個(gè)小室隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)用于統(tǒng)計(jì)分析。

9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，進(jìn)行方差齊性及正態(tài)性檢驗(yàn)。多組間差異的顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，多組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鑒定

PASMCs在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)呈梭形、三角形等,見圖1。PASMCs經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，DAB顯色，有97%的細(xì)胞漿中可見與細(xì)胞長軸平行的棕黃色肌絲，即α-SMA,見圖2。PASMCs免疫熒光染色，可見胞漿被FITC標(biāo)記的熒光Ⅱ抗染成綠色，胞核被DAPI染成藍(lán)色,見圖3。上述結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)成功培養(yǎng)PASMCs。

Figure 1. Morphology of rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells(×100).

圖1大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

Figure 2. α-SMA immunocytochemistry (A,×100； B,×1 000).

圖2α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色

2FHL1siRNA轉(zhuǎn)染效能檢測

PASMCs經(jīng)FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染后， FHL1 mRNA表達(dá)(5.277±0.918)與陰性轉(zhuǎn)染組(33.198±10.730)相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4A。FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組較陰性轉(zhuǎn)染組FHL1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖4B。這些結(jié)果證實(shí)實(shí)驗(yàn)成功進(jìn)行FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染。

Figure 3. α-SMA immunofluorescence staining of rat pulmonary arterial smooth muscle cells (×400).

圖3大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞α-SMA免疫熒光染色

Figure 4. FHL1 mRNA (A) and protein (B) expression in PASMCs afterFHL1 siRNA transfection. 1: blank control group; 2: negative transfection group; 3: FHL1 siRNA transfection group.Mean±SD.n=3.**P<0.01vs2.

圖4FHL1siRNA轉(zhuǎn)染后肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中FHL1mRNA和蛋白的表達(dá)

3CSE對(duì)細(xì)胞增殖的影響

不同濃度的CSE對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)24 h后，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖，1%、3%、5%、10%和20% CSE組細(xì)胞吸光度與0%組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中5%CSE對(duì)PASMCs增殖影響最明顯，見圖5。因此本實(shí)驗(yàn)選用5%作為CSE干預(yù)PASMCs的濃度。

Figure 5. The proliferation of PASMCs after treatment with different concentrations of CSE. Mean±SD.n=4.**P<0.01vs0% CSE.

圖5不同濃度CSE干預(yù)后肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖情況

4CSE對(duì)細(xì)胞FHL1mRNA和蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移的影響

CSE組FHL1蛋白表達(dá)較空白組明顯增加(P<0.01)，見圖6。但CSE組與空白組FHL1 mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(79.879±8.669和75.636±5.257，P>0.05)。CSE組細(xì)胞遷移較空白組明顯增加，見圖7。

Figure 6. FHL1 protein expression in PASMCs in blank control and CSE groups. 1: blank control; 2: CSE group.

圖6空白組與CSE組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中FHL1蛋白的表達(dá)

Figure 7. The migration of PASMCs 24 h after CSE intervention (crystal violet staining,×400). A: blank control group; B: CSE group.

圖7CSE干預(yù)細(xì)胞24h后細(xì)胞的遷移

5CSE與FHL1siRNA轉(zhuǎn)染共同干預(yù)對(duì)PASMCsFHL1蛋白表達(dá)及增殖和遷移的影響

CSE+FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組FHL1蛋白表達(dá)較CSE組及CSE+陰性轉(zhuǎn)染組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖8。CSE+FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖及遷移均較CSE組及CSE+陰性轉(zhuǎn)染組減弱(P<0.01)，見表1。

Figure 8. FHL1 protein expression after CSE stimulation andFHL1 siRNA transfection. 1: blank control group; 2: negative transfection group; 3:FHL1 siRNA transfection group; 4: CSE group; 5: CSE + negative transfection group; 6: CSE +FHL1 siRNA transfection group. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs1;##P<0.01vs2;△△P<0.01vs4 or 5.

圖8CSE及FHL1siRNA轉(zhuǎn)染分別及共同干預(yù)后FHL1蛋白的表達(dá)

表1各組細(xì)胞增殖和遷移結(jié)果

Table 1. The proliferation and migration of PASMCs (Mean±SD.n=4)

GroupProliferationMigrationBlankcontrol0.732±0.03323.250±2.986Negativetransfection0.687±0.02823.250±1.708FHL1siRNAtransfection0.547±0.032**##7.250±1.258**##CSE0.950±0.067**35.750±2.062**CSE+negativetransfection0.955±0.079##35.250±2.754##CSE+FHL1siRNAtransfection0.792±0.024△△18.750±3.363△△

**P<0.01vsblank control;##P<0.01vsnegative transfection;△△P<0.01vsCSE or CSE+negative transfection.

討 論

FHL1蛋白是指含有4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，是FHL蛋白家族的重要成員之一，它主要參與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞增殖、分化以及凋亡[11]。FHL1基因位于人類染色體Xq27 上，編碼FHL1蛋白[12]。許多疾病通過FHL1基因的突變引起氨基酸殘基結(jié)構(gòu)的改變而影響LIM結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展[7]。早在1994年，就有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，含LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白在骨骼肌細(xì)胞中高表達(dá)，并在其生長、分化和遷移中起到非常重要的作用[13]。但是，有關(guān)FHL1在血管平滑肌細(xì)胞中的作用研究甚少。Weng等[5]在大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌的研究中發(fā)現(xiàn)FHL1在人胸主動(dòng)脈夾層血管平滑肌中表達(dá)明顯降低，提示FHL1與血管平滑肌功能相關(guān)。而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染，有效減少FHL1 mRNA及FHL1蛋白的表達(dá)，可導(dǎo)致PASMCs的增殖和遷移減弱，相似的結(jié)果也同樣出現(xiàn)于Kwapiszewska 等[4]在人原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的研究中，說明FHL1與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān)。

香煙煙霧暴露與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CSE干預(yù)大鼠遠(yuǎn)端PASMCs，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增加。但是隨著CSE濃度的提高，其對(duì)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移作用并沒有繼續(xù)增加。這與Hu等[14]及Silva等[15]的發(fā)現(xiàn)一致。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選定5%CSE用于實(shí)驗(yàn)的干預(yù)，這與諸多國內(nèi)外學(xué)者在細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中選用的CSE濃度是一致的。CSE組平滑肌細(xì)胞增殖和遷移均較空白組明顯增高。由于肺血管重塑主要表現(xiàn)為血管壁平滑肌細(xì)胞的重新排列和增生改變，因此我們認(rèn)為CSE所導(dǎo)致的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和遷移與肺血管重塑密切相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，CSE導(dǎo)致PASMCs增殖及遷移增加，伴FHL1蛋白增加，提示FHL1蛋白與CSE所致的PASMCs增殖和遷移相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)中，CSE刺激并未導(dǎo)致FHL1 mRNA表達(dá)增加，究其原因，可能是CSE導(dǎo)致的FHL1蛋白增加的機(jī)制不是通過促進(jìn)FHL1 mRNA表達(dá)，而是通過抑制FHL1蛋白的降解。目前相關(guān)研究表明，細(xì)胞內(nèi)蛋白降解主要通過2條途徑，即自噬和泛素蛋白酶體系統(tǒng)[16]。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可通過檢測以上2條途徑中的相關(guān)基因來進(jìn)一步明確CSE導(dǎo)致FHL1蛋白表達(dá)增加的機(jī)制。

CSE干預(yù)初步提示FHL1蛋白與CSE所致PASMCs的增殖及遷移增加有關(guān)，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步行FHL1 siRNA干預(yù)，發(fā)現(xiàn)CSE+FHL1 siRNA轉(zhuǎn)染組與CSE+陰性轉(zhuǎn)染組相比，CSE導(dǎo)致的細(xì)胞增殖和遷移作用隨著FHL1表達(dá)的抑制而減弱了。這進(jìn)一步證實(shí)CSE促進(jìn)PASMCs增殖和遷移通過FHL1蛋白起作用。這一結(jié)果，也為香煙煙霧暴露所致的肺血管重塑和肺動(dòng)脈高壓的分子靶向治療提供了研究方向。

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EffectsofFHL1onproliferationandmigrationofratpulmonaryarterialsmoothmusclecellsstimulatedbycigarettesmoke

PU Gui-mei1, YANG Li1, LI Yu-ping1, CHEN Cheng-shui1, JIANG Lei2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,2LongwanMedicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou325000,China.E-mail:wzliyp@qq.com)

AIM: To explore the role of four-and-a-half LIM domain 1 (FHL1) in the proliferation and migration of rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMCs) stimulated by cigarette smoke extract (CSE).METHODSRat distal PASMCs were isolated and primarily cultured. The cells were divided into 6 groups: blank control group, negative transfection group,FHL1 siRNA transfection group, CSE group, CSE + negative transfection group and CSE +FHL1 siRNA transfection group. The mRNA and protein expression of FHL1 was detected by real-time PCR and Western blotting, respectively. Cell proliferation and migration were determined by CCK-8 and Transwell assays, respectively.RESULTSCSE promoted the proliferation and migration of PASMCs, and increased the expression of FHL1 protein (P<0.01), but did not change the expression of FHL1 mRNA (P>0.05).FHL1 siRNA transfection attenuated the proliferation and migration of PASMCs induced by CSE (P<0.01).CONCLUSIONFHL1 protein is involved in CSE-induced proliferation and migration of rat PASMCs.

FHL1 protein; Smoking; Pulmonary arterial smooth muscle cells

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.024

1000- 4718(2013)11- 2049- 05

2013- 06- 05

2013- 07- 30

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.LQ13H010002)；溫州市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.Y20100292)

△ 通訊作者 Tel： 0577-55579276； E-mail： wzliyp@qq.com