趙 紅 ，顧定偉，焦萬(wàn)玲，黃宇玲，劉培光，趙麗娜，于海艷

(1.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211;2.河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 唐山 063000;3.唐山市豐潤(rùn)區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，河北 唐山 064000)

心臟是原發(fā)性高血壓直接受累的靶器官，常表現(xiàn)為心肌肥厚、心肌纖維化、心肌組織及離子通道的重塑。目前，對(duì)于原發(fā)性高血壓病的治療主要采用藥物改善高血壓心肌膠原沉積，以及控制心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，保護(hù)靶器官。實(shí)驗(yàn)研究顯示，非選擇性醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯能下調(diào)纖維母細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)［3］，改善原發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚及膠原的沉積［4-5］，下調(diào)心肌梗死大鼠Ⅰ、Ⅲ膠原mRNA 的表達(dá)［6］。臨床研究顯示［7-8］，螺內(nèi)酯可改善心衰癥狀，減少心肌梗死后及擴(kuò)張型心肌病患者Ⅰ、Ⅲ膠原合成的血清標(biāo)志物。但血清標(biāo)志物及mRNA 水平不能完全代表心肌組織局部膠原蛋白水平。因此，本研究以原發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertension rat，SHR)為研究對(duì)象，觀察非選擇性醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯對(duì)原發(fā)性高血壓心肌纖維化進(jìn)展期心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原的影響，探討螺內(nèi)酯抗高血壓心肌纖維化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 雄性7 周齡SHR 20只，體重120～150 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。雄性7 周齡Wistar-kyoto 鼠7 只(WKY組)，體重120～150 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。SHR 隨機(jī)分為兩組:螺內(nèi)酯組(10 只)和對(duì)照組(10 只)。實(shí)驗(yàn)大鼠普通飼料喂養(yǎng)1 周，第8 周齡開(kāi)始，螺內(nèi)酯組SHR 每天給予螺內(nèi)酯20 mg/kg，雙蒸水溶解灌胃，對(duì)照組SHR 和WKY組大鼠在同一時(shí)間同容量雙蒸水灌胃。每周測(cè)大鼠體重，隨體重增加調(diào)整給藥量，連續(xù)16 周，飼養(yǎng)在恒溫、恒濕、人工光照明暗各12 h 的安靜飼養(yǎng)室內(nèi)。

1.2 標(biāo)本采取 三組大鼠滿24 周齡，測(cè)量體重，20%烏拉坦1 g/kg 腹腔內(nèi)注射麻醉，迅速打開(kāi)胸腔，取出心臟，用預(yù)冷的生理鹽水充分灌洗，濾紙吸干，沿房室環(huán)減去房室游離壁和右室游離壁，分離出左心室，用鋒利手術(shù)刀自左心室心底部至心尖部橫斷為2 片，做好標(biāo)記。其中1 片立即投入液氮罐中，用于Ⅰ型膠原Western blot 的檢測(cè);第2 片立即置入10%中性甲醛固定液中，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 主要試劑 十二烷基硫酸鈉、Tris baseβ、巰基乙醇、丙烯酰胺、N，N'-亞甲雙丙烯酰胺由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司進(jìn)口分裝;考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250、Sirius Red為Sigma 公司產(chǎn)品;溴酚藍(lán)購(gòu)自生工生物工程有限公司;兔抗胎鼠皮膚Ⅰ型膠原單克隆抗體購(gòu)自CALBOCHEM 公司;預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自Fermentas 公司;鼠抗3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購(gòu)自康成生物工程有限公司。

1.4 天狼猩紅-苦味酸染色 心肌組織采用10%中性甲醛固定24 h，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，厚度5μm。天青石藍(lán)液10 min，蒸餾水沖洗3次，每次5 min;天狼猩紅飽和苦味酸染色30 min，無(wú)水乙醇分化30 s，二甲苯透明光學(xué)樹(shù)膠封固。天狼猩紅染色在光鏡下細(xì)胞核呈綠色，膠原呈紅色，其它成分呈黃色;在偏振光顯微鏡下，Ⅰ型膠原纖維呈紅色和黃色，Ⅲ型膠原呈綠色的細(xì)纖維。采用Nikon E600POL 偏振光顯微鏡Pixerra Penguin 150ES CCD2Image Pro Plus 5.5 圖像分析系統(tǒng)，計(jì)算Ⅰ、Ⅲ型膠原面積，用像素?cái)?shù)表示。Ⅰ/Ⅲ膠原比值=Ⅰ型膠原總面積/Ⅲ型膠原總面積。

1.5 心肌組織Ⅰ型膠原Western blot 檢測(cè) 精確稱取三組大鼠心肌組織100 mg，PBS 洗凈，剪碎至1 mm 大小，1 ml 0.5 mol/L 冰乙酸膨脹過(guò)夜，4℃勻漿，10 000 r/min 離心25 min，加入胃蛋白酶，4℃消化攪拌6 h，加入Tris 至pH 7.4 終止酶解。Bradford 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE 和Western blot 參照二版分子克隆，加樣量為25μl，GAPDH 作為內(nèi)參，ECL 試劑盒顯影。計(jì)算機(jī)自動(dòng)圖像分析軟件系統(tǒng)對(duì)條帶所在面積進(jìn)行Ⅰ型膠原灰度累積分析，并與內(nèi)參條帶灰度進(jìn)行校對(duì)作為最后結(jié)果(Ⅰ型膠原灰度/GAPDH 灰度)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件程序處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示，不同組間數(shù)值比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中螺內(nèi)酯組和對(duì)照組大鼠各死亡1 只。

2.1 免疫印跡法測(cè)定螺內(nèi)酯對(duì)SHR 心肌組織Ⅰ型膠原水平的影響 與WKY組比較，對(duì)照組心?、裥湍z原明顯升高(P＜0.05);治療16周，與對(duì)照組比較，螺內(nèi)酯組左心室Ⅰ型膠原含量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1，圖1)。

2.2 偏振光顯微鏡觀察螺內(nèi)酯對(duì)SHR 左室心?、瘛⒛z原像素積分及Ⅰ/Ⅲ比值影響 與WKY組比較，對(duì)照組心?、裥湍z原像素及Ⅰ/Ⅲ比值升高(P＜0.05);與對(duì)照組比較，螺內(nèi)酯組Ⅰ型膠原像素減少，Ⅰ/Ⅲ比值下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但三組間Ⅲ型膠原未見(jiàn)明顯差異。見(jiàn)表1，圖2。

圖1 三組大鼠左心室心?、裥湍z原蛋白免疫印跡放射自顯影Fig.1 Western blot results of collagen type Ⅰin left ventricular among the three groups

表1 Western blot 及偏振光顯微鏡觀察3組大鼠左室心?、?、Ⅲ膠原及Ⅰ/Ⅲ比值Table 1 The levels of collagen type Ⅰ，Ⅲ and Ⅰ/Ⅲ ratio by Western blot and polatized light microscopy

圖2 三組大鼠左室天狼猩紅染色心肌組織學(xué)Fig.2 Histopathology of left ventricular in the three groups by sirius red stain

3 討論

SHR 是一種慢性高血壓模型。實(shí)驗(yàn)顯示［9］，SHR 在6 周時(shí)血壓開(kāi)始增高，但不穩(wěn)定，血管周圍纖維化已經(jīng)出現(xiàn)，但無(wú)心肌間質(zhì)纖維化;14 周時(shí)血壓持續(xù)增加，心肌羥脯氨酸含量增高，稱為增高期。24 周血壓趨于穩(wěn)定，心肌間質(zhì)纖維化明顯增加。本研究為觀察螺內(nèi)酯對(duì)原發(fā)性高血壓進(jìn)展期心肌膠原的影響，因此選用8 周齡SHR 作為實(shí)驗(yàn)起點(diǎn)治療16 周，24 周齡為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

螺內(nèi)酯為非選擇性醛固酮受體拮抗劑，其男性乳房女性化和性功能障礙的副反應(yīng)隨劑量增大而增加;有研究發(fā)現(xiàn)［1］，12.5～25.0 mg/d螺內(nèi)酯對(duì)血液動(dòng)力學(xué)無(wú)明顯影響，但能有效阻斷醛固酮受體，當(dāng)每日用量大于50.0 mg 時(shí)可產(chǎn)生高血鉀。目前該藥臨床除用于調(diào)節(jié)體液代謝外，常規(guī)用量多為每天12.5～25.0 mg［11］。為此，本實(shí)驗(yàn)參照臨床用量，選用螺內(nèi)酯為20 mg/(kg·d)。與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)不同，螺內(nèi)酯可抑制22個(gè)月正常大鼠心肌纖維化的發(fā)生，具有抵抗大齡和老化所致的心臟退行性改變［12］，而ACEI 藥物沒(méi)有這樣的作用，因此對(duì)于螺內(nèi)酯抗心肌纖維化機(jī)制越來(lái)越多地受到人們的關(guān)注。

心肌組織間質(zhì)主要由Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原組成。高血壓組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為心肌肥厚及Ⅰ型膠原沉積，同時(shí)存在膠原種類和分布的改變，Ⅰ/Ⅲ型膠原比值增加［13］。由于Ⅰ型膠原相對(duì)粗大，在抗張力作用及維持心室形態(tài)中發(fā)揮作用，在靜止的心臟內(nèi)需要100 mmHg 以上的壓力才能抵抗膠原的作用使室壁膨脹［14］。而Ⅲ型膠原分子纖細(xì)，在心肌的延展和回彈特性中發(fā)揮重要作用。左室的舒張包括早期的快速充盈期，是心肌主動(dòng)松弛的過(guò)程，而晚期的被動(dòng)充盈期，依賴于心肌的彈性指數(shù)。

本研究結(jié)果顯示，螺內(nèi)酯減少SHR 心肌組織Ⅰ型膠原的數(shù)量，Ⅰ/Ⅲ型膠原比值下降，對(duì)Ⅲ型膠原無(wú)明顯影響。采用天狼星紅染色，偏振光顯微鏡觀察心?、?、Ⅲ型膠原及Ⅰ/Ⅲ型膠原比值，普通光鏡觀察膠原纖維呈紅色，細(xì)胞核呈綠色，其它成分呈黃色。在偏振光顯微鏡下，Ⅰ型膠原纖維呈紅色，排列緊密;Ⅲ型膠原呈綠色的細(xì)纖維，能在同一張玻片上同時(shí)顯示Ⅰ型和Ⅲ型膠原［15］。另外，成纖維細(xì)胞內(nèi)，膠原基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，翻譯出的肽鏈經(jīng)羥化、糖基化形成前膠原，前膠原在細(xì)胞外還需相應(yīng)酶切去前體序列并進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)形成原膠原，最后聚合成膠原纖維。因此，研究螺內(nèi)酯對(duì)原發(fā)性高血壓心肌組織結(jié)構(gòu)影響，特別是膠原種類和分布及其調(diào)節(jié)機(jī)制具有重要意義。

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