尹雪瑤，李 紅，宣君麗，陳怡馨，李 霖，董雪紅

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院內(nèi)分泌科浙江省生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)發(fā)病的主要原因，但其發(fā)病機(jī)制尚未明了?，F(xiàn)有研究表明，DN可能是遺傳因素和環(huán)境因素等綜合作用的結(jié)果。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renninsystem，RAS)被認(rèn)為在糖尿病腎病發(fā)生過(guò)程中起重要作用，Ⅰ型血管緊張素Ⅱ受體(angiotensinⅡtypeⅠreceptor，AGTR1)介導(dǎo)了血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)的主要生物學(xué)效應(yīng)，因而AGTR1基因一直是糖尿病腎病研究的熱點(diǎn)。本研究運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)研究AGTR1 A1166C基因多態(tài)性在正常對(duì)照組、2型糖尿病非腎病組及糖尿病腎病組中分布頻率，以探討AGTR1基因與2型糖尿病及糖尿病腎病的相關(guān)性。

1 研究對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象均為浙江省杭州市社區(qū)居民，漢族，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。均簽署知情同意書(shū)。

1.1.1 糖尿病組 據(jù)1999年WHO糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)，入選2型糖尿病患者293例，發(fā)病年齡＞35歲。根據(jù)尿白蛋白/肌酐比值(A/C比值)分為兩組，糖尿病非腎病組:A/C比值＜30 mg/g肌酐，共141例，其中男性73例，女性68例，病程≥10年，年齡(52.99±5.39)歲，未服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ACEIARB)藥物;糖尿病腎病組:6個(gè)月內(nèi)連續(xù)3次晨尿檢查有2次A/C比值≥30 mg/g肌酐，共152例，其中，男性65例，女性87例，年齡(69.63±7.64)歲。糖尿病腎病組中微量白蛋白尿(30 mg/g肌酐≤A/C比值＜300 mg/g肌酐)109例，大量白蛋白尿(A/C比值≥300 mg/g肌酐)43例。所有患者臨床排除原發(fā)腎臟疾病、結(jié)締組織疾病、泌尿系感染、糖尿病急性代謝并發(fā)癥、急慢性感染、肝臟疾病、心力衰竭等。

按照改良的 MDRD公式［1］計(jì)算腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate，eGFR)，并根據(jù)eGFR將糖尿病患者分為兩組，eGFR下降組:eGFR＜60 ml/(min/1.73 m2)共90例;eGFR 正常組:eGFR≥60 ml/(min/1.73 m2)共203例。

1.1.2 正常對(duì)照組 體檢健康者，無(wú)糖尿病、高血壓及腎臟疾病家族史，且葡萄糖耐量試驗(yàn)排除糖尿病和糖調(diào)節(jié)異常，共157例，其中，男性65 例，女性92 例，年齡(68.21 ±9.69)歲。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床和生化檢查 測(cè)晨8:00～9:00時(shí)坐位測(cè)量右上臂肱動(dòng)脈收縮壓(SBP)和舒張壓(DBP)3次，取其平均值。測(cè)量腰圍、身高、體重，根據(jù)BMI=體重/身高2(kg/m2)計(jì)算體質(zhì)指數(shù)。取空腹靜脈血測(cè)定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)，糖化血紅蛋白(HbA1c)。留取晨尿，測(cè)定尿白蛋白和肌酐，通過(guò)免疫散射比濁法測(cè)定尿白蛋白，并計(jì)算A/C比值。

1.2.2 AGTR1基因多態(tài)性的檢測(cè) 按照DNA提取試劑盒操作方法提取外周血DNA，引物參照Doria等［2］的設(shè)計(jì)，由上海Invotrogen公司合成。引物1:5'-CAC CAT GTT TTG AGG TT-3'，引物 2:5'-CGA GTT TCT GAC ATT GTT C-3。以PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)步驟:95℃預(yù)變性10 min，95℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共循環(huán)30次，72℃終末循環(huán)10 min，最后置于4℃終止反應(yīng)。A1166C變異導(dǎo)致DdeⅠ限制性?xún)?nèi)切酶切位點(diǎn)的出現(xiàn)。PCR產(chǎn)物用DdeⅠ于37℃酶切4 h。2%瓊脂糖凝膠電泳(恒壓120 V+電泳液為1×TAE)，紫外燈下觀察結(jié)果。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為AGTR13'端非編碼區(qū)5'末端1058～1331 bp之間274 bp的DNA。擴(kuò)增產(chǎn)物中無(wú)A1166C突變切點(diǎn)則為274 bp片段，若擴(kuò)增片段中存在A-C堿基替換則產(chǎn)生DdeⅠ切點(diǎn)，經(jīng)酶切后產(chǎn)生165 bp和109 bp的片段。AA基因型只有一條274 bp片段，CC基因型含有165 bp和109 bp 2條片段，含有以上3條片段的為AC雜合基因型(圖1)。選取部分樣本PCR后測(cè)序，鑒定基因型與酶切結(jié)果(圖2)。

圖1 AGTR1基因型DdeⅠ酶切電泳結(jié)果Fig.1 Result of genotypes of AGTR1 gene detected by DdeⅠdigestion

圖2 AGTR1基因型測(cè)序結(jié)果Fig.2 Result of AGTR1 genotype sequencing

2 結(jié)果

2.1 各組間臨床和生化指標(biāo)的比較 與正常對(duì)照組比較，糖尿病非腎病組年齡、男性比例、腰圍、BMI、SBP、Scr、FPG、LDL-c、HbA1c、A/C比值均高于正常對(duì)照組，TC值低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);糖尿病腎病組年齡、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、LDL-c、HbA1c、A/C比值均顯著高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而糖尿病腎病組與糖尿病非腎病組比較，糖尿病腎病組BMI、TG、A/C比值顯著高于糖尿病非腎病組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 正常對(duì)照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組的臨床資料Table 1 Clinical data of the normal controls，simple diabetes and diabetic nephropathy groups

表2 正常對(duì)照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組的生化指標(biāo)Table 2 Laboratory data of the normal controls，simple diabetes and diabetic nephropathy groups

2.2 各組AGTR1 A1166C變異分布頻率 表3示正常對(duì)照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組等位基因分布情況，各組研究對(duì)象基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。在正常對(duì)照組、糖尿病非腎病組、糖尿病腎病組A和C等位基因的分布頻率分別為 96.5%、97.2%、92.8% 和 3.5%、2.8%、7.2%。其中，糖尿病腎病組C等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組(χ2=4.26，P ＜ 0.05)和糖尿病非腎病組(χ2=5.83，P ＜0.05)，而糖尿病非腎病組和正常對(duì)照組等位基因分布未見(jiàn)明顯差異(χ2=0.21，P ＞0.05)。ACCC 基因型頻率在糖尿病腎病組與正常對(duì)照組或糖尿病非腎病組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.86，P ＜0.05 或 χ2=5.44，P＜0.05)。

糖尿病腎病組中的微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組A等位基因和C等位基因分布頻率分別為 91.3%、96.5% 和 8.7%、3.5%。兩組間等位基因及基因型頻率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.355，P ＞0.05 和 χ2=2.51，P ＞0.05)，見(jiàn)表4。

表3 正常對(duì)照組、糖尿病非腎病組和糖尿病腎病組的基因型和等位基因分布Table 3 Distribution of genotypes and allele frequency in normal controls，simple diabetes and diabetic nephropathy groups ［n(%)］

表4 微量白蛋白尿組和大量白蛋白尿組基因型和等位基因分布Table 4 Distribution of genotypes and allele frequency in microalbuminuria and proteinuria groups［n(%)］

2.3 糖尿病患者腎病和非腎病組及eGFR正常和下降組Logistic回歸分析 以糖尿病患者是否發(fā)生腎病為分類(lèi)變量，以年齡、性別、腰圍、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、TC、LDL、HDL、HbA1c和AGTR1 A1166C基因型為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，經(jīng)逐步選擇表明，高 BMI、DBP、TG和AGTR1ACCC基因型為糖尿病發(fā)生腎病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，ACCC基因型與AA基因型相比對(duì)，糖尿病腎病比值比(OR)為2.672(95%CI:1.170 ～ 6.104)，用 Logistic 回歸校 正 后 OR 為 3.184(95%CI:1.277 ～7.934)，見(jiàn)表5。

以糖尿病患者是否發(fā)生eGFR下降為分類(lèi)變量，以年齡、性別、病程、腰圍、BMI、SBP、DBP、FPG、TG、TC、LDL、HDL、HbA1c、A/C 和AGTR1基因型為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，經(jīng)逐步選擇表明，男性、高TG和A/C為糖尿病患者發(fā)生eGFR下降的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而AGTR1 A1166C基因型未進(jìn)入方程(表5)。

表5 糖尿病患者腎病和非腎病組及eGFR正常和下降組Logistic回歸分析Table 5 Logistic regression analysis in simple diabetes and diabetic nephropathy groups，and eGFR normal and low groups

3 討論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(reninangiotensin-aldosterone system，RAAS)內(nèi)的基因一直被認(rèn)為是糖尿病腎病的重要候選基因。因?yàn)樵撓到y(tǒng)對(duì)于全身和腎臟內(nèi)的血液動(dòng)力學(xué)具有明顯的調(diào)控作用。在糖尿病患者中AngⅡ?qū)τ诮M織的損害，除了通過(guò)激活血管緊張素受體和下游的通路，還可通過(guò)與其他經(jīng)典的高血糖誘導(dǎo)的病理生理途徑的相互作用(如氧化應(yīng)激，糖基化終末產(chǎn)物，蛋白激酶C、多元醇途徑，己糖胺途徑)發(fā)揮作用［3-4］。

改善血糖和控制血壓，以及應(yīng)用RAAS抑制劑后可明顯延緩糖尿病腎病的發(fā)生，但仍有相當(dāng)數(shù)量的糖尿病患者雖血糖控制良好仍進(jìn)展為糖尿病腎病，這表明糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展存在著個(gè)體易感性［5］。大量的研究表明基因背景決定了糖尿病患者進(jìn)展為糖尿病腎病的風(fēng)險(xiǎn)，無(wú)論是蛋白尿或腎小球損傷的程度，及患者的藥物治療效果都存在著明顯的家族聚集性［6］。

人類(lèi)AGTR1基因位于3q21-25，僅含1個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子區(qū)域。A1166C位于3'端非編碼區(qū)域，不編碼蛋白質(zhì)，可能通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)揮作用。關(guān)于AGTR1 A1166C基因多態(tài)性和糖尿病腎病關(guān)系的研究結(jié)果并不盡一致。Doria等［2］發(fā)現(xiàn)，C等位基因同血糖控制不佳的糖尿病患者腎病的發(fā)生相關(guān)，而Tomino等［7］對(duì)于日本2型糖尿病婦女的研究也發(fā)現(xiàn)，C等位基因與糖尿病腎病的進(jìn)展相關(guān)。在體外C等位基因還可介導(dǎo)AngⅡ的作用增強(qiáng)［8］。Chowdhury等［9］的研究卻并未發(fā)現(xiàn) A1166C與糖尿病腎病的發(fā)生相關(guān)。另外有研究發(fā)現(xiàn)，AA基因型與非糖尿病患者的腎病的迅速發(fā)展相關(guān)［10］。

本研究以社區(qū)人群為研究對(duì)象，可使基因型更符合人群中的分布，再者，糖尿病非腎病組篩選病程≥10年，而且為未服用ACEIARB類(lèi)藥物的2型糖尿患者，可排除短病程、藥物等因素對(duì)于該組患者尿蛋白排泄的影響，使結(jié)果更可靠。但是，由于36.18%糖尿病腎病患者服用ACEIARB類(lèi)藥物，該類(lèi)藥物對(duì)糖尿病腎病組患者腎功能和尿蛋白的影響未能完全排除。另外，由于大量白蛋白尿組樣本量較小，也可能掩蓋了基因多態(tài)性對(duì)于糖尿病腎病進(jìn)展的影響。

本研究顯示，糖尿病腎病組C等位基因的頻率顯著高于正常對(duì)照組和糖尿病非腎病組，而正常對(duì)照組和糖尿病非腎病組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明AGTR1基因是糖尿病腎病的易感基因(OR=2.672，95%CI:1.170 ～6.104)，而非糖尿病易感基因。經(jīng)Logistic回歸分析表明高BMI、DBP、TG和AGTR1基因型中 C等位基因?yàn)樘悄虿∧I病獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，該研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相一致［11］。但由于基因作用的復(fù)雜性，AGTR1 A1166C參與糖尿病腎病的發(fā)生分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步的研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)AGTR1 A1166C基因多態(tài)性和糖尿病腎病的易感性相關(guān)。對(duì)于糖尿病腎病易感基因的深入研究，將有助于糖尿病腎病高危患者的早期篩查、靶向治療及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。此外，不同基因型的患者對(duì)藥物也有不同的反應(yīng)［12］，進(jìn)一步的研究對(duì)于指導(dǎo)臨床用藥也具有重要的意義。

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