秦 學 趙新燕 李洪彬

0 引言

隨著現(xiàn)代制藥行業(yè)的快速發(fā)展，大規(guī)模高純度地分離制備某種藥物單一有效組分是目前研究的重點和難點，如何以最低的提取成本獲得最高的提純純度和最大的純品產(chǎn)率也是藥企最關心的問題。色譜分離技術是最主要的分離純化技術之一，制備色譜是分離科學中最有效的制備型分離技術，是很多研究領域和生產(chǎn)車間必不可少的分離手段，高壓制備液相色譜已成為當今高效分離和純化技術研究的重點和前沿。從20世紀初發(fā)展至今，色譜技術在理論上已從線性色譜發(fā)展到非線性色譜，在實踐中則從分析規(guī)模發(fā)展到制備和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模。工業(yè)制備色譜越來越被認為是應對制藥工業(yè)中純化挑戰(zhàn)的最有效工具。本文將詳細介紹工業(yè)制備液相色譜系統(tǒng)的構成及應用情況，為設備下一步的推廣應用提供技術指導和參考。

1 制備液相色譜與分析液相色譜的區(qū)別

1.1 制備液相色譜

制備型色譜（非線性色譜），一般進樣量要比分析型色譜大的多。要求能有適當?shù)姆蛛x度，并要考慮目標產(chǎn)物的純度、產(chǎn)量、生產(chǎn)周期、運行成本等。用于分離、富集或純化混合物中的某一或某些組分，上柱量可為克、千克級乃至更多。

1.2 分析液相色譜

分析型色譜（線性色譜），分析色譜需要全面地反映樣品組成的信息，希望能在盡可能小的進樣量情況下，提供盡可能高的組分分辨率和線性的分離特性，但不必收集特定組分，洗脫液通常廢棄。用于對被測組分的高精度分析；樣品上柱量可低至微克級。

由以上可以看出，制備型液相色譜與分析型液相色譜的差別在于后者的目的在于鑒別及鑒定，不需對樣品進行回收；而前者的目的在于從一混合物中分離得到純化合物，是一個純化的過程。制備型液相色譜的上樣量較大，通常需要特定的裝置和一定的操作條件。

2 工業(yè)制備液相色譜系統(tǒng)構成

與分析型液相色譜一樣，工業(yè)制備液相色譜系統(tǒng)一般也由制備色譜柱、高壓輸液泵及進樣泵、在線檢測器、餾分收集裝置、工作站軟件、電氣控制系統(tǒng)以及液相輔助部分構成。圖1所示為聊城萬合工業(yè)制造有限公司自主研發(fā)的300型工業(yè)制備液相色譜系統(tǒng)外觀圖，圖2為色譜分離操作的簡單流程圖。下面將重點介紹每部分結構的主要特性。

2.1 制備色譜柱

色譜柱是色譜工藝的核心。它主要涉及2個方面：柱技術（包括柱設計和裝柱）和填料。

動態(tài)軸向壓縮（Dynamic Axial Compression，DAC）技術是目前公認的制備色譜柱（特別是柱徑大于100 mm）的最佳技術。其基本原理是選定適當?shù)奶盍献鳛楣潭ㄏ?，勻漿后注入制備色譜柱，操作動態(tài)柱液壓控制系統(tǒng)，使活塞壓縮并擠出勻漿液，使柱床產(chǎn)生設定的內(nèi)部壓強，并保證柱床穩(wěn)定。其核心技術是通過活塞的上下運動來裝柱、維持柱壓和卸柱，活塞運動和壓力維持靠的是液壓，液壓動力比彈簧動力的軸向壓縮柱更穩(wěn)定，更均勻。活塞周邊配備的特殊設計的密封圈，既能容許活塞上下自由滑動，又能保持高的密封壓。DAC技術能在大規(guī)模工藝放大中保持很好的重現(xiàn)性，例如內(nèi)徑1 600 mm的高壓DAC柱已經(jīng)商品化應用于實際生產(chǎn)中。圖3所示為DAC柱的原理圖。

至于填料，市場上已有許多成熟產(chǎn)品應用于工業(yè)制備液相色譜中，大部分為國外生產(chǎn)，特別是高質(zhì)量、高性能填料國內(nèi)生產(chǎn)的還很少。填料的物理、化學特性是柱系統(tǒng)選擇的重要參數(shù)，一般根據(jù)生產(chǎn)工藝選擇，但對于大規(guī)模制備液相色譜柱來說，推薦使用填料粒徑一般在10～40μm為宜，考慮到設備壓力等因素，不推薦使用小于5μm的填料。

2.2 高壓制備輸液泵（洗脫用）及進樣泵

高壓輸液泵是工業(yè)制備液相分離提純的關鍵部件，其作用是將流動相以穩(wěn)定的流速或壓力輸送到色譜分離系統(tǒng)中。目前使用最廣、性能最穩(wěn)定的是雙柱塞型往復式恒流泵（圖4）。與分析型輸液泵不同的是，工業(yè)制備用泵流量要大得多，一般在1 L/min（60 L/h）以上，對于直徑超過1 000 mm的制備系統(tǒng)，流量可達100 L/min（6 000 L/h），但壓力沒有分析泵高，一般小于20 MPa。

由于柱徑增大上樣量也跟著提升，一般需要單獨進樣泵來實現(xiàn)快速大量進樣。進樣泵的設計與洗脫用輸液泵原理一致，也是柱塞式往復恒流泵。為了節(jié)約成本，可以用一臺泵即實現(xiàn)洗脫功能，同時也可用于進樣，這時只需連接一個可以切換的三路并聯(lián)入口閥即可實現(xiàn)。

2.3 在線檢測器

檢測器也是工業(yè)制備液相色譜系統(tǒng)的三大關鍵部件之一。檢測器是用于連續(xù)監(jiān)測被色譜系統(tǒng)分離后的柱流出物組成和含量變化的裝置。其作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉(zhuǎn)化為可供檢測的電信號，完成定性定量分析的任務。常用色譜檢測器有紫外—可見光檢測器（UV—Vis）、示差折光指數(shù)檢測器、電導檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器，其中UV紫外—可見光檢測器應用最廣泛，使用率在70%以上。

工業(yè)制備用色譜檢測器，一般來說要實現(xiàn)在線監(jiān)測功能，必須換用高流通量的專用流通池，以保證大流量的柱后溶液能夠迅速被檢測分離，保證回收的餾分純度。

2.4 餾分收集裝置

通過動態(tài)軸向壓縮柱洗脫的柱后溶液，經(jīng)過檢測器分析檢測后分流到不同的儲液罐實現(xiàn)收集。用戶可以按樣品分離后組分流出的先后次序，或按時間、或按色譜峰的起止信號，根據(jù)控制軟件預先設定好的程序，自動完成收集工作。其工作原理：在無組分流出時，氣控閥與廢液瓶連接，當某一個組分流出時，對應某個氣控閥會切換至打開（收集）位置，同時廢液閥關閉，收集一個組分，以此重復，直至最后一個組分收集完成后，廢液閥切回原處，完成一個樣品的收集工作。如圖5所示。

2.5 電氣控制裝置

電氣控制系統(tǒng)主要實現(xiàn)以下功能：變頻器脈沖信號控制；多路氣動閥控制信號；信號采集；通過觸摸屏面板進行簡單的現(xiàn)場操作控制。

2.6 工作站軟件

主要用于數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)處理、儀表控制的色譜數(shù)據(jù)處理站。圖形化的人機界面，具有可編程的邏輯監(jiān)控和操作界面系統(tǒng)，包括監(jiān)控程序、操作程序和外部設備；用戶控制系統(tǒng)確保安全、可靠、連續(xù)。能夠顯示設備運行過程中的實時在線監(jiān)測數(shù)據(jù)，包括壓力、流量、檢測波長信息等。聊城萬合工業(yè)制造有限公司自主研發(fā)的工作站軟件操作界面如圖6所示。

3 工業(yè)制備液相色譜分離操作的一般步驟

對于沒有接觸過制備液相色譜設備和操作的人員來說，如何快速使用制備液相色譜設備進行分離操作是他們最關心的問題。下面將簡單介紹如何進行制備液相色譜的分離生產(chǎn)操作。

3.1 明確制備柱分離前期目標

3.1.1 了解樣品性質(zhì)

包括樣品的組成、基體的物理或化學性質(zhì)、復雜性（合成產(chǎn)品還是天然產(chǎn)品）、各組分的性質(zhì)、相態(tài)（固態(tài)還是液態(tài)，溶解度等）、濃度（目標物在樣品中是大量還是微量存在）、價值（原料是否昂貴、易得，目標物價值是否昂貴）。只有掌握樣品的初步情況，才能在后面建立分離方法時有的放矢，節(jié)省人力物力。

3.1.2 明確純度要求

對于制備型分離，產(chǎn)品通常都有純度要求，目標產(chǎn)物只要達到我們要求的生產(chǎn)純度指標要求即可，如有些初步鑒定要求70%的純度就可以，而作定量分析用的必須要達到99%以上。只有了解產(chǎn)品對純度的要求，才能建立起最經(jīng)濟適用又最高效的分離方法。

3.1.3 綜合考慮制備產(chǎn)量、時間和成本

確定制備量便于選擇色譜柱的規(guī)格型號；時間長短也是分離過程中需要考慮的重要因素，比如目標物不能經(jīng)過長時間的過程分離，必須盡快完成分離過程；多數(shù)情況下，制備型分離最后都要考慮目標收集物的制備成本，尤其是一些生物工程藥物生產(chǎn)，純化成本甚至占到產(chǎn)品成本的80%，因此必須綜合衡量各因素之間的關系。

3.2 制備型分離操作一般步驟

由于制備型色譜分離特別是工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模色譜分離需要的上樣量特別高，所需的固定相填料和消耗的洗脫用試劑量特別大，因此直接進行制備操作成本會很高。鑒于此，一般操作方法是先通過分析液相獲得基本圖譜信息和工藝條件（包括試劑種類、洗脫方式、流量、壓力、上樣量），然后放大到50 mmDAC柱進行中試實驗，摸索最佳的分離條件，然后再過渡到生產(chǎn)規(guī)模使用。制備型色譜分離操作的一般步驟如圖7所示。

4 工業(yè)制備液相色譜系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀和前景

4.1 工業(yè)制備液相色譜分離系統(tǒng)的應用現(xiàn)狀

目前，制備液相色譜已廣泛應用于天然產(chǎn)物有效成分的分離純化及天然植物提取、中草藥活性成分的分離純化、化學合成物質(zhì)的分離純化、蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的分離制備及手性分離。

已有許多文獻對采用制備液相色譜分離天然產(chǎn)物有效成分（如黃酮類化合物、苷類化合物、生物堿類化合物）中藥活性成分、蛋白多肽等進行了報道。

田娜等采用制備液相色譜法從荷葉中分離制備黃酮類化合物，純度達到99.13%。朱靖博等用動態(tài)軸向壓縮工業(yè)色譜系統(tǒng)DAC250系統(tǒng)（直徑250 mm×1 000 mm）分離丹參脂溶性單體化合物，分離出純度達98.5%的丹參酮ⅡA、96.2%的丹參酮Ⅰ以及97.8%的隱丹參酮。楊明等建立了用制備型HPLC制備石杉堿甲的方法，純度達90%以上。彭密軍等采用制備高效液相色譜技術，從杜仲葉提取物中分離純化得到高純活性成分綠原酸，綠原酸的純度達98.61%。秦學等利用制備型高效液相色譜制備天然發(fā)酵輔酶Q10并分離出雜質(zhì)，獲得目標產(chǎn)品純度達92.8%。王傳金等采用反相高效液相色譜技術，分離制備冬凌草中冬凌草甲素，產(chǎn)品純度達99%。韓金玉等采用正相液相制備色譜柱（ID80 mm×1 000 mm）分離純化三七葉甙精制物，得到了人參皂甙單體Rb3，純度達95%。蔡煥新等通過從線性分析色譜直接放大到制備液相色譜，分離得到了多個純度較高的多肽。

目前應用這些設備已成功開發(fā)出十幾種中藥有效部位及單體成分的分離純化與制備工藝技術，成分包括：抗菌素類、黃酮類、生物堿類、皂苷類、內(nèi)酯類等。前列腺素甲酯、替考拉寧、紫杉醇、銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯、槲皮素、異鼠李素、銀杏內(nèi)酯等中藥的有效成分都已找到了合適的制備工藝路線。目前文獻研究使用的制備柱柱徑范圍一般在20～100 mm，超過200 mm的工業(yè)制備應用文獻還比較少。

4.2 工業(yè)制備液相色譜分離系統(tǒng)推廣需要解決的問題和應用前景

制備液相色譜作為一種新型高效的分離技術，目前的發(fā)展趨勢是開發(fā)大規(guī)模工業(yè)應用途徑。然而，現(xiàn)有的理論結構還很不完善，不能指導制備型分離過程的放大和優(yōu)化。特別是涉及柱超載、柱設計等問題，還遠未解決。從工業(yè)應用角度出發(fā)，今后主要應解決以下幾方面問題：

對中試規(guī)模和產(chǎn)業(yè)化當中指導制備型分離過程優(yōu)化和放大的非線性色譜理論進行研究。只有在這方面取得突破性進展之后，才能掌握制備型分離過程的最優(yōu)設計。按照化學工程的觀點，對制備型分離過程進行模擬、優(yōu)化和放大研究，為整個過程最優(yōu)設計提供科學依據(jù)。開發(fā)適用于工業(yè)制備型分離過程的低成本、通用型和高選擇性填料，以降低生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)品純度。對制備型分離過程的關鍵設備—色譜柱及其內(nèi)件進行最優(yōu)設計，正確選擇流程和工藝參數(shù)，以適合工業(yè)規(guī)模的應用。

此外，工業(yè)制備色譜是一種高投入的分離技術，至今為止，主要使用在分離與純化高附加值且純度要求高的產(chǎn)品，因而在生物技術和制藥業(yè)中發(fā)展尤為迅速。遺憾的是，大規(guī)模制備液相色譜設備在我國的使用才剛剛開始，仍有待于進一步開發(fā)和研究。

隨著這些問題的逐漸解決，工業(yè)制備色譜系統(tǒng)必將在更加廣泛的領域發(fā)揮更加重要的作用，在制藥工業(yè)現(xiàn)代化進程中具有廣闊的發(fā)展與應用前景。

5 結語

工業(yè)制備色譜以其高效的分離優(yōu)勢在制藥行業(yè)分離純化研究中發(fā)揮著越來越重要的作用，特別是在天然產(chǎn)物有效成分、中藥活性成分、蛋白多肽等的分離純化工業(yè)中引起人們的廣泛關注。工業(yè)制備色譜技術由于具有其他方法無可比擬的特點及強大的分離能力必將成為分離與純化領域中的主要方法之一。我國是中草藥的發(fā)源地，具有豐富的藥材和其他天然資源，大規(guī)模工業(yè)化制備液相色譜的研究、開發(fā)、應用對我國中草藥和稀有天然資源尤其是制藥業(yè)的開發(fā)與綜合利用將會發(fā)揮出更大的作用，為臨床用藥、中藥飲片的劑型改革、中藥的現(xiàn)代化生產(chǎn)及質(zhì)量控制、進一步提高中藥藥用價值以及對我國的天然藥物進入國際市場起到極大的促進作用。（興業(yè)杯參賽論文）

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